[0351]一方面，本发明提供了包含衍生自3G8抗体的⑶R的处于基本上人源的框架中的人源化3G8抗体的片段，但是其中轻链可变结构域的至少一个CDR在序列上不同于小鼠单克隆抗体3G8轻链CDR。在一个实施方式中，所述CDR至少由于具有CDR中的一个或多个氨基酸置换例如，表2中所示的一个或多个置换(例如，⑶Rl中的位置24处的精氨酸KDRl中的位置25处的丝氨酸KDRl中的位置32处的酪氨酸KDRl中的位置33处的亮氨酸KDR2中位置50处的天冬氨酸、色氨酸或丝氨酸
[0352]在一个实施方式中，合适的⑶16A结合蛋白可包含与Hu3G8VH_l构建体的VL结构域(SEQ ID NO:71)相同或相似的轻链可变结构域序列，表6中提供了所述轻链可变结构域的序列。例如，本发明提供了包含具有如下序列的VL结构域的CD16A结合蛋白，所述序列(I)因表5中列出的O、I或更多种的⑶R置换而不同于Hu3G8VL-l的VL结构域(SEQ IDN0:71) ；(2)因表5中列出的O、I或更多种框架置换而不同于Hu3G8VL-l的VL结构域；以及(3)在剩余位置与Hu3G8VL-l的VL序列(SEQ ID NO:71)至少约80%相同，经常至少约90%且有时约至少95%相同或甚至至少约98%相同。
[0353]表5.3G8Vl结构域置换
[0354]
[0355]表6.衍生自3G8Vl的\序列*
[0356]
[0357]
[0358]*表6A中的字母表示表6B-H中的序列。
[0359]表6B:FR1
[0360]
[0361]
[0378]表6G:CDR3
[0379]
[0384]如表5和6中所示，本发明的⑶16结合蛋白的示例性VL结构域具有3G8VL、Hu3G8VL-l 或 Hu3G8VL-43 的序列(分别为 SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:71 和 SEQ ID NO:72)。编码3G8VL(SEQ ID NO:82)和Hu3G8VL_l (SEQ ID NO:71)的示例性核苷酸序列分别被提供在 SEQ ID NO:83 和 SEQ ID NO:84 中。[0385]VL结构域可具有因表2中所示的0、1、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种或至少9种置换而不同于Hu3G8VL-l的序列(SEQ ID NO:71)的序列。这些置换被认为导致增加的对CD16A的亲和力和/或减少CD16A结合蛋白对人施用时的免疫原性。在某些实施方式中，在剩余位置的序列同一性的度为至少约80 %、至少约90%、至少约95%或至少约98%。[0386]为了例示而非限制地，表6中示出了几种⑶16A结合蛋白的VL结构域的序列。包含被融合到人C K恒定结构域的这些序列的轻链与hu3G8VH重链(上文描述的)共表达以形成四聚体抗体，并测量抗体与CD16A的结合以评价与hu3G8VL-lVL结构域(SEQ ID NO:71)相比氨基酸置换的作用。VL结构域具有hu3G8VL-l、2、3、4、5、10、16、18、19、21、22、24、27、28、32、33、34、35、36、37和42的序列的构建体表现出高亲和力的结合，且hu3G8VL_15、17、20、23、25、26、29、30、31、38、39、40 和 41 表现出中级结合。包含 Hu3G8VL-l、hu3G8VL_22和 hu3G8VL-43 的 VL 结构域(分别是 SEQ ID N071、SEQ ID NO:73 和 SEQ ID NO:72)的CD16A结合蛋白被认为具有特别有利的结合性质。[0387]5.1.2.2.1 VL和/或VH结构域的组合[0388]如本领域中已知和本文在其他地方描述的，免疫球蛋白的轻链和重链可在其缔合而产生双抗体的条件下被重组表达，或可被体外组合。因此将应理解本文所述的3G8衍生的VL结构域可与本文所述的3G8衍生的VH结构域组合以产生结合CD16A的双抗体并设想了所有这类组合。[0389]为了例示而非限制地，有用的⑶16A双抗体的实例是包含至少一个VH结构域和至少一个VL结构域的双抗体，其中VH结构域来自hu3G8VH-l、hu3G8VH-22或hu3G8VH_5 (分别是 SEQ ID NO:68,SEQ ID N0:70 和 SEQ ID NO:69)而 VL 结构域来自 hu3G8VL_l，hu3G8VL_22或 hu3G8VL-43(分别是 SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:73 和 SEQ ID NO:41)。特别地，包含hu3G8VH-22 (SEQ ID NO:22)和 hu3G8VL_l、hu3G8VL_22 或 hu3G8VL_43 (分别是 SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:70 和 SEQ ID NO:72)或 hu3G8VH_5 (SEQ ID NO:69)和 hu3G8VL_l (SEQ IDNO:71)的人源化抗体具有有利的性质。[0390]技术人员将应理解，此处描述的VL和VH结构域的序列还可通过本领域已知方法例如亲和力成熟来修饰(参见Schier等人(1996) “Isolation Of Picomolar AffinityAnt1-C-ErbB-2Single-Chain Fv By Molecular Evolution Of The ComplementarityDetermining Regions In The Center Of The Antibody Binding Site,，，J.Mol.Biol.263:551-567 ；Daugherty 等人(1998) “Antibody Affinity Maturation Using BacterialSurface Display, Protein Eng.11:825-832 ;Boder等人(1997)“Yeast Surface DisplayFor Screening Combinatorial Polypeptide Libraries, ”Nat.Biotechnol.15:553-557 ；Boder 等人(2000) “Directed Evolution Of Antibody Fragments With MonovalentFemtomolar Antigen-Binding Affinity,Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A97:10701-10705;Hudson 等人(2003) “Engineered Antibodies,’^Nature Medicine9:129-39)。例如，CD16A结合蛋白可使用亲和力成熟技术修饰以鉴定具有增加的对CD16A的亲和力和/或减少的对⑶16B的亲和力的蛋白质。[0391]一种示例性的⑶16结合蛋白是小鼠3G8抗体。包含人源化的3G8的VH和VL结构域的氨基酸序列被描述在图2、9、14中并被列出在SEQ ID N0:9、SEQ ID NO =IUSEQ IDNO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQID NO:20, SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71 和 SEQ ID NO:72 中。[0392]5.2包含Fe区或其部分的双抗体[0393]本发明包括包含Fe结构域或其部分(例如，CH2或CH3结构域)的双抗体分子。在某些实施方式中，Fe结构域或其部分包含IgG2、IgG3或IgG4的Fe区的一个或多个恒定结构域(例如 ，CH2或CH3)。在其他实施方式中，本发明包括包含Fe结构域或其部分的分子，其中所述Fe结构域或其部分相对于可比较的野生型Fe结构域或其部分包含至少一种氨基酸修饰(例如，置换)。变体Fe结构域是本领域熟知的，且如在本领域熟知的任何一种结合活性或效应功能测定，例如ELISA、SPR分析或ADCC中测定的，主要用来改变包含所述变体Fe结构域的抗体的表型。这些变体Fe结构域或其部分通过赋予或改变由包含Fe结构域(或其部分)的本发明的双抗体分子所显示的效应功能而在本发明中具备用途，如功能地测定的，例如在NK依赖性或巨噬细胞依赖性测定中。被鉴定为改变效应功能的Fe结构域的变体被公开在本发明人的并行申请，国际申请W004/063351、美国专利申请公布2005/0037000 和 2005/0064514、2004 年 11 月 10 日递交的美国临时申请 60/626，510、2004年12月15日递交的60/636，663和2006年3月10日递交的60/781，564以及2005年11月10日递交的美国专利申请11/271，140和2005年12月15日递交的11/305，787中，其每一个被通过引用全部并入。[0394] 在其他实施方式中，本发明包括使用本领域已知的任何Fe变体例如，在Duncan等人(1988) “Localization Of The Binding Site For The Human High-AffinityFe Receptor On IgG，，，Nature332:563-564 ;Lund 等人(1991) “Human Fe Gamma RIAnd Fe Gamma RII Interact With Distinct But Overlapping Sites On HumanIgG，” J.1mmunol.147:2657-2662 ;Lund 等人(1992) “Multiple Binding Sites OnThe CH2Domain Of IgG For Mouse Fe Gamma RII，”Mol.1mmunol.29:53-59 ;Alegre 等人(1994) “A Non-Activating " Humanized " Ant1-CD3Monoclonal Antibody RetainsImmunosuppressive Properties In Vivo，，，Transplantation57:1537-1543 ;Hutchins 等人(1995) “Improved Biodistribution,Tumor Targeting，And Reduced ImmunogenicityIn Mice With A Gamma4Variant Of Campath-1H，” Proc.Nat 1.Acad.Sc1.U S A92:11980-11984 ;Jefferis 等人(1995) “Recognition Sites On Human IgG For Fe GammaReceptors:The Role Of Glycosylation, Immunol.Lett.44:111-117 ；Lund 等人(1995) iiOligosaccharide-Protein Interactions In IgG Can Modulate RecognitionBy Fe Gamma Receptors，，，FASEB J.9:115-119 ;Jefferis 等人(1996) “ModulationOf Fe(Gamma)R And Human Complement Activation By IgG3_Core OligosaccharideInteractions，” Immunol.Lett.54:101-104 ；Lund 等人(1996) “Multiple InteractionsOf Igg With Its Core Oligosaccharide Can Modulate Recognition By Complement AndHuman Fe Gamma Receptor I And Influence The Synthesis Of Its OligosaccharideChains，，，J.1mmunol.157:4963-4969 ；Armour 等人(1999) “Recombinant HumanIgG Molecules Lacking Fcgamma Receptor I Binding And Monocyte TriggeringActivities, nEur.J.1mmunol.29:2613-2624 ；Idusogie 等人(2000)“Mapping Of The ClQBinding Site On RituxaniA Chimeric Antibody With A Human IgGlFc，，，J.1mmunol.164:4178-4184 ；Reddy 等人(2000) “Elimination Of Fe Receptor-Dependent EffectorFunctions Of A Modified IgG4Monoclonal Antibody To Human CD4，，，J.1mmunol.164:1925-1933 ；Xu 等人(2000) “In Vitro Characterization Of Five Humanized0KT3Effector Function Variant Antibodies，”Cell.1mmunol.200:16-26 ;Idusogie等人(2001)“Engineered Antibodies With Increased Activity To Recruit Complement，”J.1mmunol.166:2571-2575 ；Shields 等人(2001) “High Resolution Mapping Of TheBinding Site On Hum an IgGlFor Fe gamma RI,Fe gamma RII，Fe gamma RIII，And FcRnAnd Design Of IgGlVariants With Improved Binding To The Fe gamma R，”J.Biol.Chem.276:6591-6604 ;Jefferis 等人(2002) “Interaction Sites On Human IgG-Fc ForFcgammaR:Current Models，” Immunol.Lett82:57-65 ；Presta 等人(2002) “EngineeringTherapeutic Antibodies For Improved Function，，，Biochem.Soc.Trans.30:487-490)；US5，624，821 ；US5, 885，573 ；US6, 194，551 ；PCT W000/42072 ；PCT W099/58572 中公开的 Fe变体；上述文献每一个被通过引用全部并入本文。[0395]在某些实施方式中，对Fe区的氨基酸的所述一种或多种氨基酸修饰减弱了该Fe区并因此减弱了本发明的双抗体分子对一种或多种Fe Y R受体的亲和力和亲合力。在特定的实施方式中，本发明包括包含变体Fe区或其部分的双抗体，其中相对于野生型Fe区所述变体Fe区包含至少一种氨基酸修饰，该变体Fe区只结合一种Fe Y R，其中所述Fe Y R是FcyRIIIA。在另一个特定实施方式中，本发明包括包含变体Fe区或其部分的双抗体，其中相对于野生型Fe区所述变体Fe区包含至少一种氨基酸修饰，该变体Fe区只结合一种Fe Y R，其中所述Fe Y R是Fe Y RIIA。在另一个特定实施方式中，本发明包括包含变体Fe区或其部分的双抗体，其中相对于野生型Fe区所述变体Fe区包含至少一种氨基酸修饰，该变体Fe区只结合一种Fe Y R，其中所述Fe Y R是Fe Y RIIB。在某些实施方式中，本发明包括包含变体Fe结构域的分子，其中如使用本领域技术人员已知的方法和本文例示的方法测量的，相对于不包含Fe结构域或包含野生型Fe结构域的分子，所述变体给予或介导增加的ADCC活性和/或增加的与Fe Y RIIA(⑶32A)的结合。在替代实施方式中，本发明包括包含变体Fe结构域的分子，其中如使用本领域技术人员已知的方法和本文例示的方法测量的，相对于不包含Fe结构域或包含野生型Fe结构域的分子，所述变体给予或介导减少的ADCC活性(或其他效应功能)和/或增加的与Fe Y RIIB(CD32B)的结合。[0396]本发明还包括使用包含来自两种或更多种IgG同种型的结构域或区域的Fe结构域。如本领域已知的，Fe区的氨基酸修饰可深刻地影响Fe-介导的效应功能和/或结合活性。然而，当在所选IgG同种型的背景下实施时，功能特征方面的这些改变可进一步被改善和/或操控。相似地，同种型Fe的天然特征可通过一种或多种氨基酸修饰操控。由于其铰链和/或Fe结构域的氨基酸序列的差异，多种IgG同种型(即，IgGl、IgG2、IgG3和IgG4)显示出不同的物理和功能性质包括血清半衰期、补体结合、Fe Y R结合亲和力及效应功能活性(例如，ADCC、CDC)。在某些实施方式中，基于其各自的、分别的结合和/或效应功能活性独立地选择氨基酸修饰和IgG Fe区以构建具有期望特征的双抗体。在大多数实施方式中，如在IgGl的背景下本文所描述的或本领域已知的，分别地测定了所述氨基酸修饰和IgG铰链/Fe区的结合和/或效应功能活性。在某些实施方式中，当在双抗体分子或其他包含Fe的分子(例如，以及免疫球蛋白)的背景下分别地测定Fe Y R结合或效应功能时，所述氨基酸修饰和IgG铰链/Fe区显示出相似的功能性，例如增加的对Fe Y RIIA的亲和力。然后所述氨基酸修饰和所选IgG Fe区的组合可加和地或更优选协同地以相对于包含野生型Fe区的本发明的双抗体分子改变本发明的双抗体分子的所述功能性。在其他实施方式中，当在包含本文描述的或本领域已知的野生型Fe区的双抗体分子或其他含有Fe的分子(例如，免疫球蛋白)的背景下分别地测定Fe Y R结合和/或效应功能时，所述氨基酸修饰和IgG Fe区显示出相反的功能性，例如分别增加和减少对Fe Y RIIA的亲和力；随后所述“相反的”氨基酸修饰和所选IgG区域的组合相对于不包含Fe区或包含同一同种型的野生型Fe区的本发明的双抗体起到选择性地缓和或降低本发明的双抗体的特定功能性的作用。可选择地，本发明包括包含本领域已知的氨基酸修饰和所选择的IgG区域的组合、显示出新的性质的变体Fe区，当如本文所述地单独测试所述修饰和/或区域时，这些性质不能被检测到。[0397]多种IgG同种型或其结构域的功能特征是本领域熟知的。IgGl、IgG2、IgG3和IgG4的氨基酸序列呈现在图1A-1B中。 来自用于本发明的方法中的特定IgG同种型的两个或更多个结构域的选择和/或组合可基于亲本同种型的任何已知参数包括对Fe Y R的亲和力(表7 ;Flesch等人(2000)“Functions Of The Fe Receptors For Immunoglobulin G，，，J.Clin.Lab.Anal.14:141-156 ；Chappel 等人(1993) “Identification Of A Secondary FeGamma RI Binding Site Within A Genetically Engineered Human IgG Antibody，，，J.Biol.Chem.33:25124-25131 ;Chappel 等人(1991) “Identification Of The Fe GammaReceptor Class I Binding Site In Human IgG Through The Use Of Recombinant IgGl/IgG2Hybrid And Point-Mutated Antibodies，” Proc.Natl.Acad.Sc1.USA88:9036_9040，在此通过引用将其每一个全部并入本文)。例如，如果双抗体被期望构建成将对活化性受体的结合最大化并将对抑制性受体的结合最小化，则使用显示出有限地结合或不结合FcyRIIB的IgG同种型，例如IgG2或IgG4的区域或结构域可具备特定用途。相似地，来自已知优先结合Clq或Fe Y RIIIA的IgG同种型，例如IgG3的Fe区或结构域(Briiggemann等人(1987) “Comparison Of The Effector Functions Of Human Immunoglobulins UsingA Matched Set Of Chimeric Antibodies，” J.Exp.Med.166:1351—1361)的使用可与本领域已知增强ADCC的Fe氨基酸修饰组合以构建使得效应功能活性，例如，补体活化或ADCC被最大化的双抗体分子。[0398]表 7.结合 Fe Y R 的 IgG 的一般特征，改编自 Flesch 和 Neppert, 1999，J.Clin.Lab.Anal.14: 141-156
[0400][0401]Α只结合复合的IgG[0402]5.3分子偶联物[0403]本发明的双抗体分子可被重组融合或化学偶联到(包括共价和非共价偶联)异源多肽(即，无关多肽；或其部分，优选地至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90或至少100个氨基酸的多肽)以产生融合蛋白。融合不一定必须是直接的，而是可通过接头序列产生。[0404]另外，本发明的双抗体分子(B卩，多肽)可被偶联到改变了特定生物学反应的治疗剂或药物部分。作为直接偶联的替代方案，由于多价，例如四价的本发明的双抗体分子上的多个表位结合位点，该双抗体的至少一个结合区域可被设计为结合治疗剂或期望的药物部分而不影响双抗体结合。[0405]治疗剂或药物部分不应被解释为局限于典型的化学治疗剂。例如，药物部分可以是具有期望的生物学活性的蛋白质或多肽。这些蛋白质可包括例如，毒素例如相思豆毒素、蓖麻毒素A、假单胞菌外毒素(即，PE-40)或白喉毒素、蓖麻毒素、多花白树毒蛋白和美洲商陆抗病毒蛋白，蛋白质例如肿瘤坏死因子，干扰素包括但不限于α-干扰素(IFN-α)、β-干扰素(IFN-β)、神经生长因子(NGF)、血小板衍生生长因子(TOGF)、组织纤溶酶原激活物(TPA)、凋亡剂(例如，PCT公布第W097/33899号中公开的TNF-a、TNF-β、AIM I)、AIMII (参见，PCT 公布第 W097/34911 号)、Fas 配体和 VEGI (PCT 公布第 W099/23105 号)、血栓剂或抗血管生成剂(例如，制管张素或内皮抑制素)或生物学反应改良剂例如，诸如淋巴因子(例如，白介素-1 ( “IL-1”)、白介素-2( “IL-2”)、白介素-6( “IL-6”)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(“GM-CSF”)和粒细胞集落刺激因子(“G-CSF”)、巨噬细胞集落刺激因子(“M-CSF”)或生长因子(例如，生长激素(“GH”)；蛋白酶或核糖核酸酶。[0406]本发明的双抗体分子(即，多肽)可被融合到标志序列例如肽上以促进纯化。在优选的实施方式中，标志氨基酸序列是六组氨酸肽，例如PQE载体(QIAGEN，Inc.,9259Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311)中提供的标签，除了其他以外，这些载体中的许多是市售的。如在 Gentz 等人(1989) “Bioassay For Trans-Activation UsingPurified Human Immunodeficiency Virus TAT-Encoded Protein:Trans-ActivationRequires mRNA Synthesis, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 86:821-824 中所述的，例如，六组氨酸提供了方便的融合蛋白纯化。对纯化有用的其他肽标签包括但不限于对应于衍生自流感血凝素蛋白的表位的血凝素“HA”标签(Wilson等人(1984) “The Structure Of AnAntigenic Determinant In A Protem,，，Cell, 37:767-778)和“flag”标签(Knappik 等人(1994)“An Improved Affinity Tag Based On The FLAG Peptide For The Detection AndPurification Of Recombinant Antibody Fragments, ^Biotechniques,17(4):754-761)。[0407]另外的融合蛋白可通过基因改组、基序改组、外显子改组和/或密码子改组(统称为“DNA改组”)的技术产生。DNA改组可用来改变本发明的分子的活性(例如，具有更高亲和力和更低的离解速率的表位结合位点)。通常，参见，美国专利第5，605，793 ;5，811，238 ；5，830，721 ;5，834，252 和 5，837，458 号，以及 Patten 等人(1997) “Applications Of DNAShuffling To Pharmaceuticals And Vaccines,，’Curr.0pinion Biotechnol.8:724-733 ；Harayama(1998) ^Artiffcial Evolution By DNA Shuffling,，，Trends Biotechnol.16:76-82 ；Hansson 等人(1999) “Evolution Of Differential Substrate SpecificitiesIn Mu Class Glutathione Transferases Probed By DNA Shuffling,，，J.Mol.Biol.287:265-276 ；以及 Lorenz o 等人(1998) “PCR-Based Method For The Introduction OfMutations In Genes Cloned And Expressed In Vaccinia Virus,，，BioTechniques24:308-313(这些专利和出版物中的每一个在此被通过引用全部并入本文)。本发明的双抗体分子或编码本发明的分子的核酸还可通过易错PCR、随机核酸插入或其他重组之前的方法进行随机突变来改变。编码本发明的分子的多核苷酸的一个或多个部分可与一种或多种异源分子的一个或多个部件、基序、区段、部分、结构域、片段等重组。[0408]本发明还包括被偶联到或免疫特异性地识别期望增加/减少和血清半衰期和/或被靶向到特定亚群的细胞的诊断剂或治疗剂或任何其他分子的本发明的双抗体分子。本发明的分子可在诊断上使用，例如，作为例如确定特定治疗方案的疗效的临床测试程序的一部分来监控疾病、疾患或感染的发展或进展。将本发明的分子偶联到可检测物质或通过免疫特异性地识别所述可检测物质的分子可促进检测。可检测物质的实例包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料、放射性材料、发射正电子的金属以及非放射性顺磁金属离子。可检测物质可被直接地或使用本领域已知的技术通过中间产物(例如，诸如，本领域已知的连接子)间接地耦合或偶联到本发明的分子，或所述分子可免疫特异性地识别所述可检测物质:免疫特异性地结合所述物质。参见，例如美国专利第4，741，900号的金属离子，其可被偶联到抗体以用作根据本发明的诊断剂。这种诊断和检测可通过设计免疫特异性地识别所述可检测物质的分子或通过将本发明的分子偶联到可检测物质上实现，所述可检测物质包括但不限于各种酶，酶包括但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β -半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；辅基复合物，例如但不限于链霉亲和素/生物素和亲和素/生物素；荧光 材料例如但不限于伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基胺(dichlorotriazinylamine)突光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料例如但不限于鲁米诺；生物发光材料例如但不限于荧光素酶、萤光素和水母蛋白；放射材料例如但不限于铋(213Bi)、碳(14C)、铬(51Cr)、钴(57Co)、氟(18F)'礼(153GcU159Gd)、镓(68Ga、67Ga)、锗(68Ge) M(166Ho)'铟(115In、113In、112In、mIn)、碘(1311、1251、1231、121I)、镧(140La)'镥(177Lu)、锰(54Mn)、钥(99Mo)(103Pd)、磷(32P)、镨(142Pr)、钷(149Pm)、铼(186Re、188Re)、错(105Rh)、钌(97Ru)、衫(153Sm)、钪(47Sc)、硒(75Se)、银(85Sr)、硫(35S)、锝("Tc)、•它(201Ti)、锡(113Sn, 117Sn)、氣(3H)、氙(13^)、镱(169Yb、175Yb)! (9°Y)、锌(65Zn);使用各种发射正电子的线断层摄影术的发射正电子的金属，以及非放射性顺磁金属离子。[0409]本发明的双抗体分子可免疫特异性地识别或被偶联到治疗部分例如细胞毒素(例如，细胞抑制剂或杀细胞剂)、治疗剂或放射性元素(例如，α-发射体、Υ-发射体等)。细胞毒素或细胞毒性剂包括对细胞有害的任何剂。实例包括紫衫醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、吐根碱、丝裂霉素、依托泊苷、鬼白噻吩甙、长春新碱、长春花碱、秋水仙素、阿霉素、柔红霉素、二羟基蒽二酮、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、l-脱氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、心得安(propranolol)和嘌呤霉素以及其类似物或同源物。治疗剂包括但不限于抗代谢物(例如，甲氨蝶呤、6-巯嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟脲嘧啶、达卡巴嗪)、烷化剂(例如，二氯甲基二乙胺、塞替派、苯丁酸氮芥、美法仑、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲佐霉素、丝裂霉素C和顺二氯二胺钼(II) (DDP)顺钼)、蒽环霉素(例如，柔红霉素(以前的道诺霉素)和阿霉素)、抗生素(例如，放线菌素D(之前的放线菌素)、博来霉素、光神霉素和氨茴霉素(AMC)以及抗有丝分裂剂(例如，长春新碱和长春花碱)。[0410]此外，本发明的双抗体分子可被偶联到治疗部分或被设计为免疫特异性地识别治疗部分，例如放射性材料或对偶联放射性金属离子有用的大环螯合剂(参见以上放射性材料的实例)。在某些实施方式中，大环螯合剂是可通过接头分子连接到多肽的1，4，7，10-四氮杂环十二烷-N，N’，N”，N”’ -四乙酸(DOTA)。这些接头分子是本领域普遍已知的且被描述在Denardo等人(1998) “Comparison Ofl,4, 7,lO-Tetraazacyclododecane-N，N'，N"，N" 1 -Tetraacetic Acid(DOTA)-Peptide_ChL6,A Novel Immunoconjugate With Catabolizable Linker, To2-1minothiolane-2-[p-(bromoacetamido)benzyl]-D0TA_ChL6In Breast Cancer Xenografts,，，Clin.Cancer Res.4:2483-2490 ;Peterson等人(1999)“Enzymatic Cleavage Of Peptide-Linked RadiolabelsFrom Immunoconjugates,，，Bioconjug.Chem.10:553-;和 Zimmerman 等人(1999) “ATriglycine Linker Improves Tumor Uptake And Biodistributions 0f67-Cu_LabeledAnt1-Neuroblastoma mAb chCE7F (ab') 2Fragments，”Nucl.Med.Biol.26:943-950 中，其每一个被通过引用全部并入本文。[0411]用于将这些治疗部分偶联到多肽包括例如，Fe结构域的技术是熟知的；参见，例如 Arnon 等人，“Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In CancerTherapy”，在 Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy 中，Reisfeld 等人(编辑)，1985，第 243-56 页，Alan R.Liss，Inc.) ;Hellstrom 等人，“Antibodies For DrugDelivery”，在 Controlled Drug Delivery (第 2 版)，Robinson 等人(编辑)，1987，第623-53页，Marcel Dekker,Inc.) ；Thorpe/iAntibody Carriers Of Cytotoxic Agents InCancer Therapy:A Review，，,在 Monoclonal Antibodies ‘84 !Biological And ClinicalApplications 中，Pinchera 等人(编辑)，1985，第 475-506 页),Analysis，Results，And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody InCancer Therapy”，在 Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy 中，Baldwin 等人(编辑)，1985，第 303-16 页，Academic Press ;及 Thorpe 等人(1982) “ThePreparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates，，，Immunol.Rev.,62:119_158。[0412]本发明的双抗体分子可在含或不含有与之偶联的治疗部分下施用、单独地施用或与用作治疗性治疗的细胞毒性因子和/或细胞因子组合施用。如果被单独施用，多价，例如四价双抗体分子的至少一个表位可被设计成免疫特异性识别可与本发明的分子同时或在其之后施用的治疗剂，例如细胞毒性因子和/或细胞因子。以这种方式，双抗体分子可以以类似于直接偶联的方式特异性地靶向所述治疗剂。可选择地，本发明的分子可被偶联到抗体上以形成如Segal在美国专利第4，676，980号中所述的抗体异轭合物,该专利被通过引用全部并入本文。本发明的双抗体分子还可被连接到对免疫测定或靶抗原的纯化特别有用的固相载体。该固相载体包括但不限于玻璃、纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。[0413]5.4对双抗体分子的结合的表征[0414]本发明的双抗体分子可以以多种方式表征。特别地，可测定本发明的分子免疫特异性结合抗原，例如FcRIIIA或FcRIIB的能力，或如果该分子包含Fe结构域(或其部分)的话，可测定其显示出Fc-FcyR相互作用，S卩，Fe结构域(或其部分)与FcyR的特异性结合的能力。该测定可在溶液中(例如，Houghten(1992) “The Use OfSynthetic Peptide Combinatorial Libraries For The Identification Of BioactivePeptides，”BioTechniques，13:412-421)，在磁珠上(Lam(1991) “A New Type OfSynthetic Peptide Library For Identifying Ligand-Binding Activity,Mature,354:82-84)，在芯片上(Fodor (1993) “Multiplexed Biochemical Assays With BiologicalChips，nNature, 364:555-556)，在细菌上(美国专利第5，223，409号)，在孢子上(美国专利第 5，571，698 ;5，403，484 和 5，223，409 号)，在质粒上(Cull 等人(1992) “ScreeningFor Receptor Ligands Using Large Libraries Of Peptides Linked To The C TerminusOf The Lac Repressor，”Proc.Natl.Acad.Sc1.USA，89:1865-1869)或在嗷菌体上(Scott等人(1990) “Searching For Peptide Ligands With An Epitope Library，，，Science，249:386-390 ;Devlin(1990)“Random Peptide Libraries:A Source Of Specific ProteinBinding Molecules,，，Science, 249:404-406 ;Cwirla 等人(1990) “Peptides On Phage:A Vast Library Of Peptides For Identifying Ligands, jTroc.Natl.Acad.Sc1.USA,87:6378-6382 ;及 Felici(1991) “Selection Of Antibody Ligands From A Large LibraryOf Oligopeptides Expressed On A Multivalent Exposition Vector, J.Mol.Biol.,222:301-310)(这些参考文献中的每一个通过引用全文被并入本文)进行。然后可测定已被鉴定为免疫特异性结合抗原，如Fe YRIIIA的分子的针对所述抗原的特异性和亲和力。[0415]可测定已被构建为包含多个表位结合结构域的本发明的分子对一种或多种抗原(例如，癌症抗原以及与其他抗原(例如，FcyR)的交叉反应性)的免疫特异性结合，或如果这些分子包含Fe结构域(或其部分)的话，通过本领域已知的任何方法测定Fc-Fc Y R相互作用。可用来分析免疫特异性结合、交叉反应性和Fc-Fc Y R相互作用的免疫测定包括但不限于使用如下技术的竞争性和非竞争性测定系统:例如蛋白质印迹、放射免疫测定、ELISA (酶联免疫吸附测定)、“夹心”免疫测定、免疫沉淀测定、沉淀素反应、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散测定、凝集测定、补体结合测定、免疫放射测定、荧光免疫测定、蛋白质A免疫测定，仅举几个例子。这些测定是常规的且是本领域熟知的(参见，例如Ausubel等人，编辑，1994，Current Protocols in Molecular Biology,第 I 卷，John ffiley&Sons, Inc.，New York,其被通过引用全部并入本文)。[0416]抗原-结合结构域相 互作用或Fc-Fc Y R相互作用的结合亲和力以及解离速率可通过竞争性结合测定来确定。竞争性结合测定的一个实例是放射免疫测定，其包括在渐增量的未标记的表位，例如四聚体Fe YR(参见5.4.1节)的存在下用目的分子(例如，包含多个表位结合结构域的本发明的分子)孵育标记的抗原，例如四聚体Fe Y R(例如，3H或1251，参见5.4.1节)，并检测结合到被标记的抗原的分子。本发明的分子对抗原的亲和力和结合解离速率可通过Scatchard分析根据饱和数据确定。[0417]可使用本领域已知的用于抗原-结合结构域或Fc-Fc Y R相互作用的体外测定(基于生化或免疫学的测定)，包括但不限于ELISA测定、表面等离子体共振测定、免疫沉淀测定来最初确定本发明的分子对抗原或Fe Y R的亲和力和结合性质。优选地，如5.4.2部分所述，本发明的分子的结合性质还通过用于确定一种或多种Fe Y R介导的效应细胞功能的体外功能测定来表征。在最优选的实施方式中，本发明的分子在体内模型(例如本文描述并公开的模型)中具有与基于体外的测定中的结合性质相似的结合性质。然而，本发明不排除在基于体外的试验中未表现出期望的表型而在体内表现出期望的表型的本发明的分子。[0418]在某些实施方式中，优选地以高通量的方式在基于功能的测定中进行包含多个表位结合结构域和任选地，Fe结构域(或其部分)的分子的筛选和鉴定。基于功能的测定可以是本领域已知的用于表征一种或多种Fe Y R介导的效应细胞功能的任何测定，例如本文在5.4.2和5.4.3节中描述的测定。可用于根据本发明的方法使用的效应细胞功能的非限制性实例包括但不限于抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性吞噬作用、吞噬作用、调理作用、调理吞噬、细胞结合、玫瑰花结、Clq结合以及补体依赖的细胞介导的细胞毒性。[0419]在优选的实施方式中，BIAcore动力学分析用来确定本发明的分子对抗原或和FcyR的结合和解离速率。BIAcore动力学分析包括分析抗原或Fe Y R从表面上具有被固定的分子(例如，分别包含表位结合结构域或Fe结构域(或其部分)的分子)的芯片上的结合或解离。5.4.3节中描述了 BIAcore分析。[0420]优选地，使用本领域技术人员已知的任何一种技术的荧光活化细胞分选(FACS)被用于基于免疫学或功能的测定以表征本发明的分子。流动分选器能够快速地检测已被本发明的分子结合例如调理的大量的单个细胞(例如，每小时I千万至I亿个细胞)(Shapiro等人(1995)Practical Flow Cytometry)。另外,用于优化双抗体行为的特定参数包括但不限于抗原浓度(即，Fe Y R四聚体复合体，参见5.4.1节)、动力学竞争时间或FACS严格性，其每一种可被改变以选择双抗体分子，包括显示出特定的结合性质，例如同时结合多个表位的本发明的分子。用于分选和检测生物细胞的流式细胞仪是本领域熟知的。例如在美国专利第 4，347，935 ;5，464，581 ;5，483，469 ;5，602，039 ;5，643，796 和 6，211，477 号中描述了已知的流式细胞仪；其全部内容被通过引用并入本文。其他已知的流式细胞仪是由Becton Dickinson and Company 制造的 FACS Vantage™ 系统和由 Union Biometrica 制造的C0PAS™系统。[0421]对靶抗原的结合亲和力或Fc-Fc Y R结合亲和力的表征，以及对细胞表面上靶抗原或Fe Y R密度的评价可通过本领域熟知的方法，例如Scatchard分析或通过使用例如Quantum™ Simply Cellular ® (Bangs Laboratories, Inc., Fishers, IN)的试剂盒按照厂家说明进行。如本领域技术人员已知的或本文描述的，所述一种或多种功能测定可以是本领域已知的用于表征一种或多种Fe Y R介导的效应细胞功能的任何测定。在特定实施方式中，在ELISA测定中测定包含多个表位结合结构域和任选地，以及Fe结构域(或其部分)的本发明的分子对一种或多种靶抗原或一种或多种Fe Y R，例如Fe Y RIIIA、Fc Y RIIA、FcyRIIA的结合；然后进行一种或多种ADCC测定。在某些实施方式中，还使用基于表面等离子体共振的测定，例如BIAcore测定了本发明的分子。基于表面等离子体共振的测定是本领域熟知的，且在5.4.3节被进一步讨论并被本文例示在例如实施例6.1中。[0422]在最优选的实施方式中，还在动物模型中表征了包含多个表位结合结构域和任选地，以及Fe结构域(或其部分)的本发明的分子与靶抗原(例如，FcyR)的相互作用或Fc-Fc Y R相互作用。如果Fc-Fc y R相互作用待被评价，则优选的用于本发明的方法中的动物模型为，例如表达人Fe Y R的转基因小鼠，例如被通过引用全部并入本文的美国专利第5，877， 397和6，676，927号中描述的任何小鼠模型。用于这些方法中的另外的转基因小鼠包括但不限于携带人Fe YRIIIA的敲除了 Fe YRIIIA的裸鼠；携带人Fe y RIIA的敲除了FcyRIIIA的裸鼠；携带人Fe Y RIIB和人Fe Y RIIIA的敲除了 Fe Y RIIIA的裸鼠；携带人Fe Y RIIB和人Fe Y RIIA的敲除了 Fe y RIIIA的裸鼠；携带人Fe y RIIIA和Fe y RIIA的敲除了 FcyRIIIA和FcyRIIA的裸鼠以及携带人Fe Y RIIIA、FcyRIIA和FcyRIIB的敲除7 FcyRIIIA, Fe Y RIIA 和 FcyRIIB 的裸鼠。[0423]5.4.1包含Fe Y R的结合测定[0424]对包含Fe结构域(或其部分)和/或包含对Fe YR特异性的表位结合结构域的分子对Fe Y R的结合的表征可使用任何Fe Y R，包括但不限于Fe Y R的多态变体进行。在某些实施方式中，使用在位置158处包含苯丙氨酸的Fe Y RIIIA的多态变体。在其他实施方式中，使用在位置158处包含缬氨酸的Fcyriiia的多态变体进行表征。Fe YRIIIA158V显示出比158F高的对IgGl的亲和力和增加的ADCC活性(参见，例如Koene等人(1997) “Fe gammaRIIIa-158V/F Polymorphism Influences The Binding Of IgGBy Natural Killer Cell Fe gammaRIIla, Independently Of The Fe gammaRIIIa-48L/R/H Phenotype,，，Blood, 90:1109-14 ;Wu 等人(1997) “A Novel Polymorphism OfFcgammaRIIIa(CD16)Alters Receptor Function And Predisposes To AutoimmuneDisease，”J.Clin.1nvest.100:1059_70，其二者都被通过引用全部并入本文)；如最近通过IgGl-Fc Y RIIIA共结晶研究表明的，该残基实际上与IgGl的较低铰链区直接相互作用，参见，例如 Sondermann 等人(2000) “The3.2_A Crystal Structure Of The HumanIgGlFc Fragment-Fc ga.mma.RTTT complex,，，Nature, 406 (6793):267-273,其被通过引用全部并入本文。研究已表明在某些实例中，治疗性抗体在FcyRIIIA-158V纯合患者中具有提高的功效。例如，与Fe YRIIIA158F纯合患者相比，人源化的抗-⑶20单克隆抗体利妥昔单抗在治疗上在FcyRIIIA158V纯合的患者中更有效(参见，例如，Cartron等人(2002) “Therapeutic Activity Of Humanized Ant1-CD20Monoclonal Antibody AndPolymorphism In IgG Fe Receptor FcgammaRIIIA Gene,，，Blood, 99 (3):754-758)。在其他实施方式中，包含该区域的治疗性分子在Fe Y RIIIA-158V和Fe y RIIIA-158F杂合的患者中，和在具有Fe YRIIA-131H的患者中可能也是更有效的。虽然不期望被特定的作用机制所束缚，但是用替代的同种异型选择本发明的分子可提供这样的变体，所述变体一旦被构建成治疗性双抗体，将在临床上对所述同种异型纯合的患者更有效。[0425]开发了用于确定本发明的分子与Fe YR的结合，且特别是用于确定Fe结构域与Fe Y R的结合的Fe Y R结合测定。尽管受体对其配体的固有地弱的亲和力，例如对于Fe Y RIIB和Fe Y RIIA在微摩尔范围内，但是该测定允许Fc-Fc Y R相互作用的检测和定量。在国际申请W004/063351和美国专利申请公布2005/0037000和2005/0064514中详细地描述了该方法，其每一个在此被通过引用全部并入本文。简单地讲，该方法包括形成可用于本领域已知的任何标准免疫测定，例如FACS、ELISA、表面等离子体共振等的Fe Y R复合体。另外，该Fe Y R复合体相对于未复合的Fe Y R具有提高的对Fe区的亲合力。根据本发明，优选的分子复 合体是四聚体免疫复合体，包括:(a) Fe Y R的可溶性区域(例如，Fe YRIIIA、Fe Y RIIA或Fe YRIIB的可溶性区域)；(b)可操作地连接到Fe Y R的可溶性区域(例如，FcyRIIIA, Fe Y RIIA或Fe Y RIIB的可溶性区域)的C末端的生物素化的15个氨基酸的AVITAG序列(AVITAG);以及(c)链霉亲和素-藻红蛋白(SA-PE);以形成四聚体FcyR复合体的摩尔比(优选地以5: I的摩尔比)。使用例如，大肠杆菌的BirA酶，一种特异性地生物素化15个氨基酸的AVITAG序列中的赖氨酸残基的生物素连接酶酶促地生物素化融合蛋白。然后将生物素化的可溶性Fe Y R蛋白质与SA-PE以IX SA-PE: 5X生物素化的可溶性Fe Y R的摩尔比混合以形成四聚体Fe Y R复合体。[0426]已表明包含Fe区的多肽以比单体的、未复合的Fe Y R至少高8倍的亲和力结合四聚体Fe Y R复合体。包含Fe区的多肽与四聚体Fe Y R复合体的结合可使用本领域技术人员已知的标准技术，例如诸如荧光激活细胞分选(FACS)、放射免疫测定、ELISA测定等确定。[0427]本发明包括使用包含本发明的分子并根据上述方法形成的免疫复合体以在基于细胞的测定或无细胞测定中确定包含Fe区的分子的功能性。[0428]为了方便起见，这些试剂可被提供在测定药盒，即被包装的用于测定包含Fe区的分子结合Fe Y R四聚体复合体的能力的试剂的组合。用于确定Fc-Fc Y R相互作用的其他形式的分子复合体，也被设想为用于本发明的方法中，例如按在2003年I月13日递交的美国临时申请60/439，709中的描述形成的融合蛋白；该申请被通过引用全部并入本文。[0429]5.4.2具有变体重链的分子的功能测定[0430]本发明包括使用本领域技术人员已知的用于鉴定分子的效应细胞功能的测定来表征包含多个表位结合结构域和任选地，Fe结构域(或其部分)的本发明的分子。特别地，本发明包括表征本发明的分子的Fe Y R-介导的效应细胞功能。另外，如果本发明的双抗体分子的至少一个靶抗原是Fe Y R，则该双抗体分子对Fe Y R的结合可用来活化与通过Fe Y R-Fc结合活化的通路相似的Fe Y R-介导的通路，因此，如果该双抗体分子的至少一个表位结合结构域识别Fe Y R，则双抗体分子可引发Fe Y R-介导的效应细胞功能而不包含Fe结构域(或其部分)或没有同时的Fc-Fc Y R结合。可根据本发明测定的效应细胞功能的实例包括但不限于抗体依赖性细胞介导的细胞毒性、吞噬作用、调理作用、调理吞噬、Clq结合以及补体依赖性细胞介导的细胞毒性。可使用本领域技术人员已知的用于确定效应细胞活性的任何基于细胞的测定或无细胞的测定(对于效应细胞测定，参见Perussia等人(2000) “Assays For Antibody-Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity(ADCC)AndReverse ADCC(Redirected Cytotoxicity)In Human Natural Killer Cells,，，MethodsMol.Biol.121:179-92 ;Baggiolini 等人(1988) “Cellular Models For The DetectionAnd Evaluation Of Drugs That Modulate Human Phagocyte Activity, ^Experientia,44(10):841-848 ；Lehmann 等人(2000) “Phagocytosis !Measurement By FlowCytometry,，，J.1mmunol.Methods, 243 (1-2):229-42 ;Brown (1994) “In Vitro AssaysOf Phagocytic Function Of Human Peripheral Blood Leukocytes:ReceptorModulation And Signal Transduction,，，Methods Cell Biol.,45:147-64;Munn 等人(1990) “Phagocytosis Of Tumor Cells By Human Monocytes Cultured In RecombinantMacrophage Colony-Stimulating Factor,，，J.Exp.Med., 172:231-237, Abdul-Majid 等人(2002) “Fe Receptors Are Critical For Autoimmune Inflammatory Damage To TheCentral Nervous System In Experimental Autoimmune Encephalomyelitis,^Scand.J.Tmmunol.55:70-81 ;Ding等人(1998)“Two Human T Cell Receptors Bind In A SimilarDiagonal Mode To The HLA_A2/Tax Peptide Complex Using Different TCR AminoAcids, ” Immunity8:403-411,其每一个被通过引用全部并入本文)。[0431]在一个实施方式中，可在人单核细胞中测定本发明的分子的Fe Y R介导的吞噬作用。可选择地，可在可使用本领域技术人员已知的标准程序获得的其他吞噬细胞，例如中性白细胞(多形核白细胞；PMN);人外周血单核细胞、单核细胞来源的巨噬细胞中测定本发明的分子的Fe Y R-介导的吞卩遼作用(例如，参见Brown(1994) “In Vitro Assays OfPhagocytic Function Of Human Peripheral Blood Leukocytes:Receptor ModulationAnd Signal Transduction, ”Methods Cell Biol.,45:147-164)。在一个实施方式中，本发明的分子的功能通过由之前描述的方法测量THP-1细胞吞噬荧光素化的IgG-调理的绵羊红细胞(SRBC)的能力表征 (Tridandapani 等人(2000) “The Adapter Protein LATEnhances Fcgamma Receptor-Mediated Signal Transduction In Myeloid Cells,，，J.Biol.Chem.275:20480-20487)。[0432]用于确定本发明的分子的吞噬作用的另一种示例性测定是抗体依赖的调理吞噬测定(ADCP)，其可包括下列步骤:用(i)野生型4-4-20抗体，一种针对荧光素的抗体(参见Bedzyk 等人(1989) “Comparison Of Variable Region Primary Structures Within AnAnt1-Fluorescein Idiotype Family, ^J.Biol.Chem, 264 (3): 1565-1569,其被通过引用全部并入本文)，作为对于Fe Y R-依赖性ADCP的对照抗体；或(ii)具有敲除了对Fe y RIII的结合的D265A突变的4-4-20抗体，作为对于Fe y R-依赖性的ADCP的背景对照；(iii)包含4-4-20的表位结合结构域和Fe结构域和/或对Fe Y RIII特异性的表位结合结构域的双抗体包被祀生物颗粒，例如大肠杆菌(Escherichia coli)标记的FITC(Molecular Probes)或金黄色葡萄球菌-FITC ;并形成被调理的颗粒；以1: 1、10: 1、30: 1、60: 1、75: I或100:1的比例向THP-1效应细胞(可从ATCC获得的单核细胞系)中加入所述的任何一种被调理的颗粒以允许发生Fe Y R-介导的吞噬作用；优选地在37°C下孵育细胞和大肠杆菌-FITC/抗体1.5小时；孵育后向细胞中加入台盼蓝(优选地在室温下持续2-3min)以猝灭粘附到细胞表面外部而未被内化的细菌的荧光；将细胞转移到FACS缓冲液(例如，PBS中的0.1% BSA.0.1%叠氮钠)中，使用FACS(例如，BD FACS Calibur)分析THPl细胞的荧光。优选地，通过FACS分析用于该测定中的THP-1细胞的细胞表面上Fe Y R的表达。THP-1细胞表达⑶32A和⑶64。⑶64是在根据本发明的方法进行ADCP测定时被封闭的高亲和力Fe Y R0优选地用100 μ g/mL的可溶性IgGl或10%的人血清封闭THP-1细胞。为分析ADCP的程度，优选地将门(gate)设置在THP-1细胞上并测定中值荧光强度。计算对于单独的突变体的ADCP活性并报告为针对所获得的野生型chMab4-4-20的标准化值。将调理的颗粒加至THP-1细胞使得调理的颗粒与THP-1细胞的比例是30:1或60:1。在最优选的实施方式中，用对照，例如培养基中的大肠杆菌-FITC、大肠杆菌-FITC和THP-1细胞(用作Fe Y R-独立性的ADCP活性)、大肠杆菌-FITC、THP-1细胞和野生型4_4_20抗体(用作Fe Y R-依赖性的ADCP活性)、大肠杆菌-FITC、THP-1细胞、4-4-20D265A(用作Fe Y R-依赖性的ADCP活性的背景对照)进行ADCP测定。[0433]在另一个实施方式中，可使用本领域技术人员已知的任何一种标准方法测定本发明的分子在效应细胞，例如自然杀伤细胞中的Fe Y R-介导的ADCC活性(参见，例如 Perussia 等人(2000) “Assays For Antibody-Dependent Cell-MediatedCytotoxicity(ADCC)And Reverse ADCC(Redirected Cytotoxicity)In Human NaturalKiller Cells, Methods Mol.Biol.121:179-92 ;Weng 等人(2003) “Two ImmunoglobulinG Fragment C Receptor Polymorphisms Independently Predict Response To RituximabIn Patients With Follicular Lymphoma, ^J.Clin.0ncol.21:3940-3947 ；Ding 等人(1998)“Two Human T Cell Receptors Bind In A Similar Diagonal Mode To The HLA-A2/Tax Peptide Complex Using Different TCR Amino Acids,，，Immunity8:403-411)。用于石角定本发明的分子的ADCC活性的示例性测定基于51Cr释放测定，其包括:用[51Cr] Na2CrO4 (该细胞膜通透性分子通常被用于标记，因为其结合胞质蛋白质，并且虽然以慢性动力学自发地从细胞释放，但是其在靶细胞坏死后被大量释放)标记靶细胞；用包含变体重链的本发明的分子调理靶细胞；以靶细胞与效应细胞的合适比例将调理的放射标记的靶细胞与效应细胞组合在微量滴定板中；在37°C 下孵育细胞混合物16-18小时；收集上清液；并分析放射性。然后可例如使用下列公式确定本发明的分子的细胞毒性:％裂解=(实验cpm-靶渗漏cpm) / (去污剂裂解cpm-靶渗漏cpm) xlOO%。可选择地，％裂解=(ADCC-AICC) / (最大释放-自发释放)。特异性裂解可使用公式计算:特异性裂解=存在本发明的分子下的％裂解-无本发明的分子存在下的％裂解。曲线可通过改变靶:效应细胞比或抗体浓度产生。[0434]优选地用于本发明的ADCC测定中的效应细胞是使用本领域技术人员已知的标准方法，例如使用Ficol1-Paque密度梯度离心优选地从正常的人血液纯化的外周血单核细胞(PBMC)。用于本发明的方法中的优选的效应细胞表达不同的FcyR活化性受体。本发明包括表达Fe Y R1、Fc Y RIIA和Fe y RIIB的效应细胞THP-1和表达Fe y RIIIA和Fe y RIIB的从人全血获得的单核细胞来源的原代巨噬细胞，以确定重链抗体突变体是否相对于野生型IgGl抗体表现出增加的ADCC活性和吞噬作用。[0435]人单核细胞系THP-1，通过表达高亲和力受体Fe Y RI和低亲和力受体Fe Y RIIA激活吞卩遼作用(Fleit 等人(1991) “The Human Monocyte-Like Cell Line THP-1ExpressesFe Gamma RI And Fe Gamma RII，” J.Leuk.Biol.49:556-565)。THP-1 细胞不组成性地表达Fe γ RIIA或Fe γ RIIB。用细胞因子刺激这些细胞影响FcR的表达方式(Pricop等人(2001)“Differential Modulation Of Stimulatory And Inhibitory Fe Gamma ReceptorsOn Human Monocytes By ThlAnd Th2Cytokines,，，J.0f Immunol., 166:531-537) JHP-1 细胞在细胞因子IL4的存在下的生长引起Fe Y RIIB表达并导致Fe y RIIA和Fe y RI表达的减少。Fe Y RIIB表达还可通过增加的细胞密度增强(Tridandapani等人(2002) “RegulatedExpression And Inhibitory Function Of Fcgamma RIIB In Human Monocytic Cells,，，J.Biol.Chem.,277(7):5082-5089)。相比而言，已报道 IFN γ 可导致 Fe Y RIIIA 表达(Pearse等人(1993) “Interferon Gamma-1nduced Transcription Of The High-Affinity FeReceptor For IgG Requires Assembly Of A Complex That Includes The91_kDa SubunitOf Transcription Factor ISGF3，”Proc.Nat.Acad.Sc1.USA90:4314-4318)。细胞表面上受体的存在或不存在可使用本领域技术人员已知的常用方法通过FACS确定。细胞因子引起的Fe Y R在细胞表面上的表达提供了测试Fe YRIIB存在下的活化和抑制的系统。如果THP-1细胞不能表达Fe Y RIIB,则本发明还包括另一种人单核细胞系U937。已表明这些细胞在IFNy和TNF存在下最终分化成巨噬细胞(Koren等人(1979)“In Vitro ActivationOf A Human Macrophage-Like CellLine, ”Nature279:328-331)。[0436]在小鼠肿瘤模型中由巨噬细胞和NK细胞介导Fe Y R依赖性的肿瘤细胞杀伤(Clynes 等人(1998)“Fc Receptors Are Required In Passive And Active Immunity ToMelanoma, ’Troc.Nat.Acad.Sc1.USA95:652-656)。本发明包括使用来自供体的淘析的单核细胞作为效应细胞来分析Fe突变体在吞噬作用和ADCC测定中激发靶细胞的细胞毒性的效率。Fe Y R1、Fc Y RIIIA和Fe Y RIIB的表达方式受不同生长条件的影响。可使用本领域技术人员已知的常见方法确定来自冷冻的淘析的单核细胞、新鲜淘析的单核细胞、被维持在10% FBS中的单核细胞和培养在FBS+GM-CSF和或人血清中的单核细胞的Fe Y R表达。例如，可用Fe Y R特异性抗体对细胞染色并通过FACS分析以确定FcR分布型(profile)。然后将最佳地模拟巨噬细胞的体内Fe Y R表达的条件用在本发明的方法中。[0437]在某些实施方式中，尤其当不能获得具有正确的Fe Y R分布型的人细胞时，本发明包括使用小鼠细胞。在某些实施方式中，本发明包括可用人Fe Y RIIIA转染的小鼠巨噬细胞系RAW264.7 (ATCC)和使用本领域已知的方法分离到的稳定的转染子，参见，例如Ralph 等人(1977) “Antibody-Dependent Killing Of Erythrocyte And Tumor TargetsBy Macrophage-Related Cell Lines-Enhancement By PPD And LPS,，，J.1mmunol.119:950-4)。可使用常规的实验通过FACS分析对转染子的Fe y RIIIA表达进行定量且高表达子可用于本发明的ADCC测定中。在其他实施方式中，本发明包括从敲除的转基因小鼠例如本文公开的转基因小鼠中分离表达人Fe Y R的脾腹膜巨噬细胞。[0438]可使用Ficoll-Paque梯度(Pharmacia)从供体的外周血(PBM)中收集淋巴细胞。在分离的单核细胞群中，大多数的ADCC活性通过在其表面上包含Fe Y RIIIA而不是FcyRIIB的自然杀伤(NK)细胞发生。这些细胞的结果表明这些突变体在激发NK细胞的ADCC方面的功效并确定了用淘析的单核细胞测试的试剂。[0439]用于本发明的ADCC 测定中的靶细胞包括但不限于乳腺癌细胞系，例如具有ATCC 登记号 HTB-30 的 SK-BR-3(参见，例如 Tremp 等人(1976) “Human Breast CancerIn Culture, ” Recent Results Cancer Res.33-41) ;B_ 淋巴细胞；来源于伯基特淋巴瘤的细胞，例如，具有ATCC登记号CCL-86的Raji细胞(参见，例如Epstein等人(1965) “Characteristics And Mode Of Growth Of Tissue Culture Strain (EBl) OfHuman Lymphoblasts From Burkitt' s Lymphoma,，，J.Natl.Cancer Inst.34:231-240),以及具有ATCC登记号CCL-213的Daudi细胞(参见，例如Klein等人(1968) “SurfaceIgM-Kappa Specificity On A Burkitt Lymphoma Cell In Vivo And In Derived CultureLines, ”Cancer Res.28:1300-1310)。祀细胞必须被待测定的双抗体分子的抗原结合位点识别。[0440]ADCC测定基于NK细胞通过凋亡通路介导细胞死亡的能力。NK细胞通过Fe YRIIIA对结合到细胞表面上的抗原的IgG Fe结构域的识别来部分地介导细胞死亡。用于根据本发明的方法的ADCC测定可以是基于放射活性的测定或基于荧光的测定。用来表征包含变体Fe区的本发明的分子的ADCC测定包括标记靶细胞，例如SK-BR-3、MCF-7、0VCAR3、Raj1、Daudi细胞,用通过其抗原结合位点识别祀细胞上的细胞表面受体的抗体调理祀细胞；以可由常规实验确定的合适比例组合被标记的调理的靶细胞和效应细胞；收集这些细胞；基于所使用的标记使用合适的检测方案检测裂解的靶细胞的上清液中的标记。可用放射标记或荧光标记使用本领域已知的标准方法标记靶细胞。例如，这些标记包括但不限于[51Cr]Na2CrO4;以及荧光增强型配体2，2’:6’，2” -四吡啶_6_6” 二羧酸(TDA)的乙酰氧基甲酯。[0441]在特定的优选实施方式中，时间分辨荧光测定被用于测量针对已用荧光增强型配体2，2’:6’，2”_四吡啶-6-6” 二羧酸(TDA)的乙酰氧基甲酯标记的靶细胞的ADCC活性。这些突光测定是本领域普遍已知的，例如，参见Blomberg等人(1996) “Time-ResolvedFluorometric Assay For Natural Killer Activity Using Target Cells Labelled WithA Fluorescence Enhancing Ligand,’’Journal of Immunological Methods, 193:199-206,其通过引用被全部并入本文。简单地，用穿过活细胞的细胞膜快速扩散的膜通透性TDA的乙酰氧基甲基二酯(双(乙酰氧基甲基)2，2’:6’，2”_四吡啶-6-6”二羧酸(BATDA)标记靶细胞。细胞内酯酶剥除酯基且再生的膜不通透性TDA分子被捕捉在细胞内部。在37°C下，在5% CO2下孵育效应细胞和靶细胞例如持续至少两小时，最多3.5小时后，用Eu3+螯合从裂解的靶细胞中释放的TDA并在时间分辨荧光计(例如，Victorl420, Perkin Elmer/Wallace)中对所形成的Europium_TDA螯合物的突光定量。[0442]在另一个特定实施方式中，用来表征包含多个表位结合位点和任选地，Fe结构域(或其部分)的本发明的分子的ADCC测定包括下列步骤:优选地，用双(乙酰氧基甲基)2，2，:6’，2”-四吡啶-叔-6”二羧酸(DELFIA BATDA Reagent, Perkin Elmer/ffallac)标记4-5xl06的靶细胞(例如，SK-BR-3、MCF-7、0VCAR3、Raji细胞)。为了最佳标记效率，用于ADCC中的靶细胞的数目应优选地不超过5xl06。向细胞中加入BATDA试剂并在37°C下，优选地在5% CO2下孵育混合物至少30分钟。然后用生理缓冲液，例如具有0.125mM亚磺吡唑的PBS以及包含0.125mM亚磺吡唑的培养基洗涤细胞。然后用包含对Fe y RIIA特异性的表位结合结构域和任选地，Fe结构域(或其部分)的本发明的分子调理(包被)被标记的靶细胞。在优选的实施方式中，用于ADCC测定中的分子也是对细胞表面受体、肿瘤抗原或癌症抗原特异性的。本发明的双抗体分子可特异性地结合任何癌症或肿瘤抗原，例如在5.6.1节列出的抗原。ADCC测定中的靶细胞根据被构建到本发明的双抗体中的表位结合位点选择，使得该双抗体特异性地结合祀细胞的细胞表面受体。[0443]向效应细胞，例如PBMC中加入靶细胞以产生约1: 1、10: 1、30: 1、50: 1、75:1或100:1的效应子:靶比。在37°C下，在5% CO2下孵育效应细胞和靶细胞至少两小时，最多3.5小时。收集细胞上清液并加入到酸性铕溶液(例如，DELFIA铕溶液，PerkinElmer/ffallac)中。在时间分辨的突光计(例如，Victorl420, Perkin Elmer/ffallac)中对所形成的铕TDA螯合物的荧光定量。最大释放(MR)和自发释放(SR)通过分别用1%TX-100和单独的培养基孵育靶细胞 确定。通过在无受试分子，例如，本发明的双抗体存在下孵育靶细胞和效应细胞测量抗体独立性细胞毒性(AICC)。优选一式三份地进行每种测定。特异性裂解的平均百分比被计算为:实验释放(ADCC)-AICC/(MR-SR)XlOO。[0444]本发明包括本领域已知和本文例示的测定来表征包含Fe结构域(或其部分)的本发明的分子对Clq的结合和对补体依赖性细胞毒性(CDC)的介导。为测定Clq结合，可进行Clq结合ELISA。示例性的测定可包含以下:在4°C下用包被缓冲液中的包含本发明的分子的多肽或起始多肽(对照)过夜包被测定平板。然后洗涤并封闭这些平板。洗涤后，可向每个孔中加入小份的人Clq并在室温下孵育2小时。进一步洗涤后，可向每个孔中加入IOOuL的绵羊抗补体Clq过氧物酶偶联的抗体并在室温下孵育I小时。可再次用漂洗缓冲液洗涤平板并可向每个孔中加入IOOul的包含OPD (O-苯二胺二氢氯化物(Sigma))的底物缓冲液。可允许通过呈现黄颜色而被观察到的氧化反应进行30分钟并通过加入IOOul的4.5NH2S04而终止。然后可在(492-405) nm下读取吸光度。[0445]为评价补体活化，可按照例如在Gazzano-Santoro等人(1997) “ANon-Radioactive Complement-Dependent Cytotoxicity Assay ForAnt1-CD20Monoclonal Antibody，” J.1mmunol.Methods202:163-171 中描述的进行补体依赖性的细胞毒性(CDC)测定，该文献被通过引用全部并入本文。简单地，可用缓冲液稀释各种浓度的包含(变体)Fe结构域(或其部分)的分子和人补体。表达双抗体分子所结合的抗原的细胞可被稀释到约IxlO6细胞/ml的密度。包含(变体)Fe结构域(或其部分)的双抗体分子、稀释的人补体和表达抗原的细胞的混合物可被加至平底组织培养96孔板中并允许在37°C和5% C02下孵育2小时以促进补体介导的细胞裂解。然后可向每个孔中加入50uL的阿尔玛蓝(Accumed International)并在37°C下孵育过夜。使用96-孔突光计通过在530nm下激发和在590nm下发射测量吸光度。可将结果表示成相对荧光单位(RFU)。可从标准曲线计算样品浓度并报告与非变体分子，即，不包含Fe结构域或包含非变体Fe结构域的分子相比，目的变体的百分比活性。[0446]5.4.3其他测定[0447]可使用本领域已知的用于表征抗原-结合结构域或Fc-Fc Y R结合的动力学参数的任何基于表面等离子体共振的测定来测定包含多个表位结合结构域和任选地，Fe结构域的本发明的分子。市售的任何SPR设备，包括但不限于可从Biacore AB(Uppsala,Sweden)获得的 BIAcore 设备；可从 Affinity Sensors (Franklin, MA.)获得的 IAsys设备；可从 Windsor Scientific Limited (Berks, UK)获得的 IBIS 系统、可从 NipponLaser and Electronics Lab (Hokkaido, Japan)获得的 SPR-CELLIA 系统以及可从Texas Instruments (Dallas, TX)获得的 SPR Detector Spreeta 可用于本发明。对于基于 SPR 技术的综述，参见 Mullet 等人(2000) “Surface Plasmon Resonance-BasedImmunoassays, ”Methods22:77-91 ;Dong 等人(2002) “Some new aspects inbiosensors,，，Reviews in Mol.Biotech.82:303-23 ;Fivash 等人(1998) “BIAcore ForMacromolecular Interaction,，，Current Opinion in Biotechnology9:97-101 ;Rich 等人(2000) “Advances In Surface Plasmon Resonance Biosensor Analysis,，，CurrentOpinion in Biotechnologyll:54-61 ;其全部被通过引用全文并入本文。另外，在美国专利第 6，373，577 ;6，289，286 ;5，322，798 ;5，341，215 ;6，268，125 号中描述的用于测量蛋白质-蛋白质相互作用的任何一种SPR设备和基于SPR的方法被设想在本发明的方法中，所有这些专利被通过引用全部并入本文。[0448]简单地，基于SPR的测定包括将结合对的一个成员固定在某个表面上，并实时地监测其与该结合对的另一个成员在溶液中的相互作用。SPR基于测量在发生复合体形成或解离的表面附近的溶剂折射率的变化。在其上发生固定的表面是传感器的芯片，该芯片是SPR技术的核心；其由用一薄层金涂覆的玻璃表面组成，并形成用于被设计为优化分子与表面的结合的一系列特殊表面的基底。各种传感器芯片是市售的，尤其是由上文列出的公司市售的，所有这些芯片可用于本发明的方法中。传感器芯片的实例包括从BIAcore AB,Inc.获得的芯片，例如传感器芯片CM5，SA，NTA和ΗΡΑ。可使用本领域已知的任何一种固定方法和化学作用将本发明的分子固定到传感器芯片的表面上，包括但不限于通过胺基的直接共价偶联、通过巯基的直接共价偶联、生物素与亲和素包被的表面的连接、醛与碳水化合物的基团的偶联以及通过组氨酸标签与NTA芯片连接。[0449]在某些实施方式中，包含多个表位结合位点和任选地Fe结构域的本发明的分子与抗原或Fe Y R结合的动力学参数可使用BIAcore设备(例如,BIAcore设备1000, BIAcoreInc.,Piscataway,NJ)确定。如上文讨论的,参见5.4.1节,任何Fe Y R可用来评价其中双抗体分子的至少一个表位结合位点免疫特异性地识别Fe Y R和/或其中双抗体分子包含Fe结构域(或其部分)的本发明的分子的结合。在特定实施方式中，Fe YR是Fe YRIIIA，更优选地可溶性的单体Fe Y RIIIA。例如，在一个实施方式中，可溶性的单体Fe YRIIIA是连接到接头-AVITAG序列的Fe Y RIIIA的胞外区(参见 2003年I月9日递交的美国临时申请第60/439,498号和2003年3月19日递交的美国临时申请第60/456，041号，其被通过引用全部并入本文)。在另一个特定实施方式中，Fe Y R是Fe Y RIIB，优选地可溶性的二聚FcyRIIB。例如，在一个实施方式中，可溶性的二聚FcyRIIB蛋白根据被通过引用全部并入本文的2003年I月13日递交的美国临时申请第60/439，709号中描述的方法制备。[0450]对于所有免疫学测定，本发明的分子对Fe YR的识别/结合可通过多个结构域实现:在某些实施方式中，本发明的分子通过所述多个表位结合结构域中的一个免疫特异性地识别FcyR;又在其中本发明的分子包含Fe结构域(或其部分)的其他实施方式中，该双抗体分子可通过Fc-Fc Y R相互作用免疫特异性地识别Fe Y R ;又在其中本发明的分子包含Fe结构域(或其部分)和免疫特异性地识别Fe Y R的表位结合位点的另外的实施方式中，该双抗体分子可通过表位结合结构域和Fe结构域(或其部分)中的一者或二者识别Fe Y R0使用BIAcore设备来确定包含多个表位结合结构域和任选地，Fe结构域(或其部分)的分子对抗原和/或Fe Y R的动力学参数的示例性测定包括下列步骤:优选地通过胺偶联化学法将第一抗原固定在传感器芯片表面的四个流动池中的一个上，使得约5000响应单位(RU)的所述第一抗原被固定在所述表面上。一旦制备了合适的表面，优选地通过以5 μ L/mL的流速注射20 μ g/mL的溶液一分钟使免疫特异性地识别所述第一抗原的本发明的分子在所述表面上经过。在该阶段结合到所述表面的本发明的分子的水平通常在400和700RU之间的范围内。接下来，将系列稀释在HBS-P缓冲液(20mM HEPESU50mM NaCl、3mMEDTA, pH7.5)中的第二抗原(例 如，Fe Y R)或Fe Y R受体以100 μ L/min注射到所述表面上。优选地通过5秒的单次注射IOOmM NaHC03pH9.4 ；3M NaCl进行分子在不同的第二抗原或受体稀释液之间的再生。本领域已知的任何再生技术被设想在本发明的方法中。[0451]一旦收集到整套数据，使用由SPR设备制造商，例如BIAcore, Inc.(Piscataway,NJ)提供的计算机算法对所得到的结合曲线全局拟合。这些算法计算了 1^&和Kws，从其推断出作为两个速率常数的比(即，Kiw/K^)的表观平衡结合常数Kd。对如何获得单独的速率常数的更详细的处理可在BIAevaluaion Software Handbook (BIAcore,Inc., Piscataway, NJ)中发现。对所产生的数据的分析可使用本领域已知的任何方法进行。对于解释所产生的动力学数据的各种方法的综述，参见MySzka(1997) “KineticAnalysis Of Macromolecular Interactions Using Surface Plasmon ResonanceBiosensors，’’Current Opinion in Biotechnology8:50-7 ;Fisher 等人(1994) “SurfacePlasmon Resonance Based Methods For Measuring The Kinetics And BindingAffinities Of Biomolecular Interactions，，，Current Opinion in Biotechnology5:389-95 ;0’ Shannessy(1994) “Determination Of Kinetic Rate And EquilibriumBinding Constants For Macromolecular Interactions:A Critique Of TheSurface Plasmon Resonance Literature.，，Current Opinion in Biotechnology,5:65-71；Chaiken 等人(1992) “Analysis Of Macromolecular InteractionsUsing Immobilized Ligands，，，Analytical Biochemistry，201:197-210 ;Morton 等人(1995) “Interpreting Complex Binding Kinetics From Optical Biosensors:A Comparison Of Analysis By Linearization, The Integrated Rate Equation， AndNumerical Integration，，，Analytical Biochemistry227:176-85 ;0’ Shannessy 等人，1996，Analytical Biochemistry236:275-83 ;其都被通过引用全文并入本文。[0452]在优选的实施方式中，使用SPR分析，例如BIAcore确定的动力学参数可用作对本发明的分子将如何在功能测定，例如ADCC中发挥功能的预测性量度。基于从SPR分析获得的动力学参数预测本发明的分子的功效的示例性方法可包括下列步骤:确定本发明的分子结合Fe Y RIIIA和Fe Y RIIB (通过表位结合结构域和/或Fe结构域(或其部分))的K解离值；针对ADCC数据绘制(I)对于Fe Y RIIIA的K解离(wt)/K解离(mut)；⑵对于Fe y RIIB的Kiw (mut)/Kiw (wt)。高于I的数字表明相对于野生型，Fe YRIIIA的离解速率减小而Fe Y RIIB的离解速率增加；并拥有增强的ADCC功能。[0453]5.5产生本发明的双抗体分子的方法[0454]本发明的双抗体分子可使用本领域熟知的各种方法产生，包括蛋白质的从头合成和编码结合蛋白的核酸的重组表达。期望的核酸序列可通过重组方法(例如，较早制备的期望多核苷酸的变体的PCR诱变)或通过固相DNA合成产生。通常使用重组表达方法。一方面，本发明提供了包含编码CD16A VH和/或VL的序列的多核苷酸；另一方面，本发明提供了包含编码CD32B VH和/或VL的序列的多核苷酸。由于遗传密码子的简并性，多种核酸序列编码各种免疫球蛋白的氨基酸序列，且本发明包括编码本文描述的结合蛋白的所有核酸。[0455]5.5.1编码本发明的分子的多核苷酸[0456]本发明还包括编码本发明的分子，包括多肽和抗体的多核苷酸。编码本发明的分子的多核苷酸可通过本领域已知的任何方法获得，且该多核苷酸的核苷酸序列可通过本领域已知的任何方法测定。[0457]一旦由本发明的方法鉴定的分子的核苷酸序列被确定，就可使用本领域熟知的方法，例如重组DNA技术、定点诱变、PCR等(参见,例如在Sambrook等人,2001, MolecularCloning,A Laboratory Manual,第 3 版.,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold SpringHarbor, NY ;和Ausubel 等人，编辑，1998, Current Protocols in Molecular Biology, Johnffiley&Sons,NY中描述的技术，其都被通过引用全部并入本文)操纵该核苷酸序列，以通过例如产生氨基酸置换、缺失和/或插入产生例如具有不同氨基酸序列的抗体。[0458]在一个实施方式中，可通过本领域已知的标准技术筛选本领域可用的人文库或任何其他文库以克隆编码本发明的分子的核酸。[0459]5.5.2本发明的分子的重组表达[0460]一旦获得了编码本发明的分子(即，抗体)的核酸序列，可使用本领域熟知的技术通过重组DNA技术产生用于产生这些分子的载体。可使用本领域技术人员熟知的方法来构建包含用于本发明的分 子的编码序列和合适的转录及翻译控制信号的表达载体。这些方法包括例如，体外重组DNA技术，合成技术以及体内基因重组。(参见，例如，在Sambrook等人，1990，Molecular Cloning, A Laboratory Manual,第 2 版，Cold Spring HarborLaboratory, Cold Spring Harbor, NY 和 Ausubel 等人编辑，1998, Current Protocols inMolecular Biology, John ffiley&Sons, NY 中描述的技术)。[0461]可通过常规技术(例如，电穿孔、脂质体转染和磷酸钙沉淀法)将包含通过本发明的方法鉴定的分子的核苷酸序列的表达载体转移到宿主细胞并然后通过常规技术培养被转染的细胞以产生本发明的分子。在特定实施方式中，本发明的分子的表达由组成型、诱导型或组织特异性启动子调控。[0462]尤其是对于完整重组免疫球蛋白分子的表达，用来表达被本发明的方法鉴定的分子的宿主细胞可以是细菌细胞例如大肠杆菌，或优选地，真核细胞。特别地，哺乳动物细胞例如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)与载体例如来自人巨细胞病毒的主要中间型早期基因启动子元件的结合是免疫球蛋白的有效表达系统(Foecking等人(1986) “Powerful AndVersatile Enhancer-Promoter Unit For Mammalian Expression Vectors,，，Gene45:101-106 ；co*ckett 等人(1990) “High Level Expression Of Tissue Inhibitor OfMetalloproteinases In Chinese Hamster Ovary Cells Using Glutamine SynthetaseGene Amplification, ”Biotechnology8:662-667)。[0463]各种宿主表达载体系统可用来表达被本发明的方法鉴定的分子。这些宿主表达系统代表可产生和顺序性地纯化本发明的分子的编码序列的工具，而且代表当被合适的核苷酸编码序列转化或转染时可原位表达本发明的分子的细胞。这些包括但不限于转化了包含被本发明的方法鉴定的分子的编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或黏粒DNA表达载体的微生物例如细菌(例如大肠杆菌和枯草杆菌(B.subtilis));转化了包含编码被本发明的方法鉴定的分子的序列的酵母重组表达载体的酵母(例如，酿酒毕赤酵母(SaccharomycesPichia));感染了包含编码被本发明的方法鉴定的分子的序列的重组病毒表达载体(例如，杆状病毒)的昆虫细胞系统；感染了包含编码被本发明的方法鉴定的分子的序列的重组病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒(CaMV)和烟草花叶病毒(TMV))或转化了包含编码被本发明的方法鉴定的分子的序列的重组质粒表达载体(例如，Ti质粒)的植物细胞系统；或具有包含来源于哺乳动物细胞的基因组的启动子(例如，金属硫蛋白启动子)或来源于哺乳动物病毒的启动子(例如，腺病毒晚期启动子；牛痘病毒7.5K启动子)的重组表达构建体的哺乳动物细胞系统(例如，C0S、CH0、BHK、293、293T、3T3细胞、淋巴细胞(参见U.S.5，807，715)、Per C.6细胞(由Crucell发育而来的人视网膜细胞)。[0464]在细菌系统中，可根据待表达的分子期望的用途来有利地选择几种表达载体。例如，当待产生大量的该类蛋白时，对于产生抗体的药物组合物来讲，指导表达高水平的易于纯化的融合蛋白产物的载体可能是期望的。这些载体包括但不限于大肠杆菌表达载体 pUR278 (Riither 等人(1983) “Easy Identification Of cDNA Clones, ” EMBO J.2:1791-1794)，其中抗体编码序列可被单独地连接到载体中，与lac Z编码区处于一个读码框中以产生融合蛋白；pIN 载体(Inouye 等人(1985) “Up-Promoter Mutations In TheIpp Gene Of Escheric hia Coli,，，Nucleic Acids Res.13:3101-3110 ；Van Heeke 等人(1989) “Expression Of Human Asparagine Synthetase In Escherichia Coli,^J.Biol.Chem.24:5503-5509);及类似载体。pGEX载体还可用来将外源多肽表达为具有谷胱甘肽S-转移酶(GST)的融合蛋白。一般地，这些融合蛋白是可溶的且可易于通过吸附和结合基质谷胱甘肽-琼脂糖磁珠，接下来在游离谷胱甘肽的存在下洗脱而得以从裂解的细胞中纯化出来。pGEX载体被设计为包括凝血酶或Xa因子蛋白酶裂解位点使得被克隆的靶基因产物可从GST部分释放出来。[0465]在昆虫系统中，苜猜尺蠖(Autographa californica)核型多角体病毒(AcNPV)用作表达外源基因的载体。病毒在草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞中生长。抗体编码序列可被单独地克隆到病毒的非必需区域(例如，多角体蛋白基因)并被置于AcNPV启动子(例如，多角体蛋白启动子)的控制之下。[0466]在哺乳动物宿主细胞中，可利用几种基于病毒的表达系统。在其中腺病毒用作表达载体的实例中，目的抗体编码序列可被连接到腺病毒转录/翻译控制复合体，例如晚期启动子和三重前导序列上。然后可通过体外或体内重组将该嵌合基因插入到腺病毒基因组中。插入到病毒基因组的非必需区域(例如，El或E3区域)将产生在被感染的宿主中成活且能够表达免疫球蛋白分子的重组病毒(例如，参见Logan等人(1984)^Adenovirus Tripartite Leader Sequence Enhances Translation Of mRNAs LateAfter Infection, ’Troc.Natl.Acad.Sc1.USA81:3655-3659)。还可需要特定的起始信号以有效地翻译所插入的抗体编码序列。这些信号包括ATG起始密码子和相邻序列。此外，起始密码子必须与期望的编码序列的读码框相符以保证整个插入物的翻译。这些外源翻译控制信号和起始密码子可具有天然和合成的多种来源。表达效率可通过包括合适的转录增强兀件，转录终止子等增强(参见 Bitter 等人(l987)“Expression And Secretion VectorsFor Yeast,，，Methods in Enzymo1.153:516-544)。[0467]另外，可选择调节插入序列的表达或以所期望的特定方式修饰和处理基因产物的宿主细胞株。对蛋白质产物的这些修饰(例如，糖基化)和处理(例如，裂解)对于该蛋白质的功能可能是重要的。例如，在某些实施方式中，构成本发明的双抗体分子的多肽可被表达为单基因产物(例如，作为单一多肽链，即，作为多蛋白前体)，需要通过天然或重组细胞机制的蛋白酶裂解以形成本发明的双抗体分子的单独多肽。因此本发明包括构建编码包含本发明的多肽的多蛋白前体分子的核酸序列，该核酸序列包括能够指导所述多蛋白前体的翻译后裂解的编码序列。多蛋白前体的翻译后裂解产生本发明的多肽。包含本发明的多肽的前体分子的翻译后裂解可发生在体内(即，在宿主细胞内，通过天然或重组细胞系统/机制，例如合适位点处的弗林蛋白酶裂解)或可发生在体外(例如，在包含具有已知活性的蛋白酶或肽酶的组合物中和/或在包含已知培养期望的蛋白酶作用的条件或试剂的组合物中孵育所述多肽链)。对重组蛋白的纯化和修饰是本领域熟知的，使得所述多蛋白前体的设计可包括易于被技术工作者容易理解的几种实施方式。任何本领域已知的蛋白酶或肽酶可用于所描述的对前体分子的修饰，例如凝血酶(其识别氨基酸序列LVPR~GS(SEQ ID NO:89))，或Xa 因子(其识别氨基酸序列 I (E/D)GR~ (SEQ ID NO:90) (Nagai 等人(1985)“0xygenBinding Properties Of Human Mutant Hemoglobins Synthesized In EscherichiaColi, ^Proc.Nat.Acad.Sc1.USA82:7252-7255,以及在 Jenny 等人(2003) “A CriticalReview Of The Methods For Cleavage Of Fusion Proteins With Thrombin And FactorXa, ”Protein Expr.Purif.31:1-11中综述的,其每一个被通过引用全部并入本文))、肠激酶(其识别氨基酸序列 DDDDK~ (SEQ ID NO:91) (Collins-Racie 等人(1995) “ProductionOf Recombinant Bovine Enterokinase Catalytic Subunit In Escherichia Coli UsingThe Novel Secretory Fusion Partner DsbA,，，Biotechnologyl3:982-987,在此其被通过引用全部并入本文))、弗林蛋白酶(其识别氨基酸序列RXXR~，优先识别RX(K/R)R~ (分别是SEQ ID N0:92和SEQ ID NO:93)(位置P6处的额外的R表现出增强裂解))以及AcTEV(其识别氨基酸序列 ENLYFQ~G(SEQ ID NO:94) (Parks 等人(1994) “Release OfProteins And Peptides From Fusion Proteins Using A Recombinant Plant VirusProteinase, ”Anal.Biochem.216:413-417,在此其被通过引用全部并入本文))和足口病病毒蛋白酶C3。参见，例如上文的6.4部分。[0468]不同的宿主细胞具有用于蛋白质和基因产物的翻译后处理和修饰的特征性和特异性机制。可选择合适 的细胞系或宿主系统以保证对所表达的外源蛋白的正确修饰和处理。为了这个目的，可使用具有用于初级转录物的适当处理、基因产物的糖基化和磷酸化的细胞器的真核宿主细胞。这些哺乳动物细胞包括但不限于CHO、VERY、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、293T、3T3、WI38、ΒΤ483、Hs578T、HTB2、BT20 和 T47D、CRL7030 以及 Hs578Bst。[0469]对于重组蛋白的长期、高产量产生，稳定表达是优选的。例如，可构建稳定地表达本发明的抗体的细胞系。不使用包含病毒复制起点的表达载体，可用被合适的表达控制元件(例如，启动子、增强子、序列、转录终止子、多腺苷化位点等)控制的DNA和选择性标记转化宿主细胞。在引入外源DNA后，可允许所构建的细胞在富集培养基中生长1-2天，并然后转换到选择性培养基中。重组质粒载体中的选择性标记提供选择抗性并允许细胞将质粒稳定地整合到其染色体中并生长为形成进而可被克隆和扩增成细胞系的集落(foci)。该方法可有利地用来构建表达本发明的抗体的细胞系。所构建的这些细胞系在筛选和评价与本发明的分子直接或间接相互作用的化合物方面可能是特别有用的。[0470]可使用几种选择系统，包括但不限于单纯性疱疹病毒的胸苷激酶(Wigler等人(1977) “Transfer Of Purified Herpes Virus Thymidine Kinase Gene To CulturedMouse Cells，”Cellll:223-232)、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(Szybalska等人(1992) “Use Of The HPRT Gene And The HAT Selection Technique II DNA-MediatedTransformation Of Mammalian Cells:First Steps Toward Developing HybridomaTechniques And Gene Therapy，”Bioessaysl4:495-500)，以及腺票呤憐酸核糖基转移酶(Lowy 等人(1980) “Isolation Of Transforming DNA:Cloning The Hamster aprtGene，” Cell22:817-823)基因可被分别用于tk_、hgprt-或aprt-细胞中。另外，抗代谢物抗性可用作针对下列基因的选择基础:dhfr，其提供对甲氨蝶呤的抗性(Wigler等人(1980) “Transformation Of Mammalian Cells With An Amplifiable Dominant-ActingGene，” Proc.Natl.Acad.Sc1.USA77:3567-3570 ;0，Hare 等人(1981) “TransformationOf Mouse Fibroblasts To Methotrexate Resistance By A Recombinant PlasmidExpressing A Prok aryotic Dihydrofolate Reductase,Proc.Natl.Acad.Sc1.USA78:1527-1531) ;gpt，其提供对霉酌.酸的抗性(Mulligan 等人(1981) “Selection For AnimalCells That Express The Escherichia coli Gene Coding For Xanthine-GuaninePhosphoribosyltransferase, ” Proc.Natl.Acad.Sc1.USA78:2072-2076) ;neo，其提供对氨基糖苷G-418 的抗性(Tolstoshev (l"3)“Gene Therapy, Concepts, Current Trials AndFuture Directions, ,?Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32:573-596 ；Mulligan (1993) “TheBasic Science Of Gene Therapy，，，Science260:926-932 ;以及 Morgan 等人(1993)“HumanGene Therapy，” Ann.Rev.Biochem.62:191-217)和 hygro，其提供对潮霉素的抗性(Santerre 等人(1984) “Expression Of Prokaryotic Genes For Hygromycin B AndG418Resistance As Dominant-Selection Markers In Mouse L CelIs.，，Gene30:147-156) o可使用的重组DNA技术领域通常已知的方法被描述在Ausubel等人(编辑)，1993，Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons, NY ;Kriegler，1990，Gene Transfer and Expression, ALaboratory Manual, Stockton Press, NY ;以及在第 12和 13 章中，Dracopoli 等人(编辑)，1994，Current Protocols in Human Genetics, JohnWiley&Sons, NY.;Colberre_Garapin 等人(1981) “A New Dominant Hybrid SelectiveMarker For Higher Eukaryotic Cells，，，J.Mol.Biol.150:1-14 中。[0471]可通过载体扩增增加本发明的分子的表达水平(对于综述，参见Bebbington和Hentschel,The use of vectors based on gene amplification for the expression ofcloned genes in mammalian cells in DNA cloning,第3卷(Academic Press,New York,1987)。当表达抗体的载体系统中的标记可扩增时，宿主细胞培养物中存在的抑制剂水平的增加将增加标记基因的拷贝数。因为被扩增的区域与双抗体分子的多肽的核苷酸序列连接，所以多妝的产生也将增加(Crouse 等人(1983) “Expression And Amplification OfEngineered Mouse Dihydrofolate Reductase Minigenes,，，Mol.Cell.Biol.3:257-266)。[0472]可用本发明的两种表达载体共转染宿主细胞，第一载体编码双抗体分子的第一多肽链，而第二载体编码双抗体分子的第二多肽链。这两种载体可包含使得能够等量表达两种多肽的相同的选择性标记。可选择地，可使用编码两条多肽的单一载体。根据本发明的分子的多肽的编码序列可包含cDNA或基因组DNA。[0473]一旦本发明的分子(即，双抗体)已被重组表达，则其通过本领域已知的用于多肽、多蛋白或双抗体纯化的任何方法(例如，与基于抗原选择性的抗体纯化方案相似)纯化，例如通过层析(例如，离子交换、亲和法，特别地通过针对特定抗原的亲和法(任选地在蛋白质A选择后，其中双抗体分子包含Fe结构域(或其部分))以及尺寸柱层析)、离心、差异溶解或通过用于纯化多肽、多蛋白或双抗体的任何其他标准技术。[0474]5.6预防性和治疗性方法[0475]本发明的分子对于治疗和/或预防其中期望由Fe Y R介导的效应细胞功能(例如，ADCC)的疾病、疾患或感染(例如，癌症，传染病)是特别有用的。如上文所讨论的，本发明的双抗体可在引发效应功能方面显示出抗体样功能，尽管该双抗体分子并不包含Fe结构域。通过包含免疫特异性地识别Fe Y R的至少一个表位结合结构域，双抗体分子可显示出Fe Y R结合和与Fc-Fc Y R相互作用相似的活性。例如，本发明的分子可结合细胞表面抗原和免疫效应细胞(例如，NK细胞)上的Fe Y R(例如，Fe Y RIIIA)，刺激针对所述细胞的效应功能(例如，ADCC,⑶C、吞噬作用、调理作用等)。[0476]在其他实施方式中，本发明的双抗体分子包含Fe结构域(或其部分)。在这些实施方式中，所述Fe结构域还可包含相对于野生型Fe结构域(或其部分)的至少一种氨基酸修饰和/或可包含来自一种或多种IgG同种型(例如，IgGl、IgG2、IgG3或IgG4)的结构域。包含变体Fe结构域的本发明的分子相对于包含野生型Fe结构域的分子可显示出被赋予的或被改变的表型， 诸如改变的或赋予的效应物功能活性(例如，如在NK依赖性或巨噬细胞依赖性测定中测定的)。在所述实施方式中，具有被赋予的或被改变的效应功能活性的本发明的分子对于治疗和/或预防其中期望效应功能活性的增强功效的疾病、疾患或感染是特别有用的。在某些实施方式中，包含Fe结构域(或其部分)的本发明的双抗体分子介导补体依赖性的级联。被鉴定为改变效应功能的Fe结构域变体被公开在本发明人的并存申请，国际申请TO04/063351、美国专利申请公布2005/0037000和2005/0064514、2004年11月10日递交的美国临时申请60/626，510、2004年12月15日递交的60/636，663和2006年3月10日递交的60/781，564以及2005年11月10日递交的美国专利申请11/271，140和2005年12月15日递交的11/305，787中，其每一个被通过引用全部并入。[0477]本发明包括用于治疗、预防或控制受治疗者的癌症的方法和组合物，该方法包括对所述受治疗者施用治疗有效量的根据本发明构建的包含一个或多个表位结合位点和任选地，Fe结构域(或其部分)的一种或多种分子，所述分子还结合癌症抗原。本发明的分子对于预防、抑制、减少原代肿瘤的生长或退化、癌细胞的转移和传染病是特别有用的。虽然不期望被特定的作用机制所束缚，但是本发明的分子介导导致肿瘤清除、肿瘤衰退或其组合的效应功能。在替代实施方式中，本发明的双抗体通过细胞表面抗原和/或受体的交联以及增强的凋亡或负生长调控信号传导介导治疗活性。[0478]虽然不期望被特定的作用机制所束缚，本发明的双抗体分子相对于本领域已知的治疗性抗体表现出增强的治疗功效，部分地由于双抗体免疫特异性地结合以减少的水平表达特定抗原(例如，FcyR)的靶细胞的能力，例如，借助由于该双抗体-表位相互作用的提高的亲合力而更长久地保持在靶细胞上的能力。[0479]具有增强的对抗原(例如，FcyR)的亲和力和亲合力的本发明的双抗体对于治疗、预防或控制受治疗者的癌症或另一种疾病或疾患是特别有用的，其中Fe Y R低水平地在靶细胞群体中表达。如本文所用的，细胞中Fe Y R的表达根据如使用本领域技术人员已知的常见方法测量的每个细胞中这类分子的密度定义。包含多个表位结合位点和任选地，Fe Y R (或其部分)的本发明的分子在以30，000至20，000分子/细胞的密度，以20，000至10，000分子/细胞的密度，以10，000分子/细胞或更小的密度，以5000分子/细胞或更小的密度，或以1000分子/细胞或更小的密度表达靶抗原，例如癌症抗原的细胞中优选地也具有被赋予的或增强的亲合力和亲和力和/或效应功能。本发明的分子在治疗、预防或控制亚群体的疾病或疾患，例如癌症方面具有特定的实用性，其中靶抗原以低水平在靶细胞群体中表达。[0480]本发明的分子还可有利地与本领域已知的用于治疗或预防疾病，例如癌症、自身免疫病、炎性疾患和传染病的其他治疗剂组合使用。在特定实施方式中，本发明的分子可与例如用来增加与所述分子的相互作用的效应细胞的数目或活性并增强免疫反应的单克隆抗体或嵌合抗体、淋巴因子或造血生长因子(诸如例如，IL-2、IL-3和IL-7)组合使用。本发明的分子还可有利地与用来治疗疾病、疾患或感染的一种或多种药物，例如诸如在5.7节详述的抗癌剂、抗炎剂或抗病毒剂组合使用。[0481]5.6.1 癌症`[0482]本发明包括用于治疗或预防受治疗者的癌症的方法和组合物，所述方法包括对所述受治疗者施用治疗有效量的包含多个表位结合结构域的一种或多种分子。在某些实施方式中，本发明包括用于在具有Fe Y R多态性的受治疗者例如对Fe Y RIIIA-158V或Fe Y RIIIA-158F等位基因为纯合的受治疗者中治疗或预防癌症的方法和组合物。在某些实施方式中，本发明包括将双抗体分子的至少一个表位结合结构域构建成免疫特异性地结合FcyRIIIA(158F)。在其他实施方式中，本发明包括将双抗体分子的至少一个表位结合结构域构建成免疫特异性地结合Fe Y RIIIA(158V)。[0483]标准单克隆抗体治疗的功效取决于受治疗者的Fe YR多态性(Cartron等人(2002)“Therapeutic Activity Of Humanized Ant1-CD20Monoclonal Antibody AndPolymorphism In IgG Fe Receptor FcRIIIa Gene,，，Blood99:754-758 ;Weng 等人(2003)“Two Immunoglobulin G Fragment C Receptor Polymorphisms IndependentlyPredict Response To Rituximab In Patients With Follicular Lymphoma,，，J ClinOncol.21 (21) 3940-3947，其二者都被通过引用全部并入本文)。这些受体被表达在效应细胞表面上并介导ADCC。低亲和力活化性受体的高亲和力的等位基因提高了效应细胞介导ADCC的能力。与依赖Fc-Fc Y R相互作用来实现效应功能相比，本发明的方法包括构建免疫特异性地识别低亲和力活化性受体的分子，允许这些分子被设计为用于特定的多态性。可选择地或另外地，本发明的分子可被构建成包含对效应细胞上的Fe Y R表现出增加的亲和力的变体Fe结构域(日对于野生型Fe结构域)。所构建的本发明的分子为患者提供了更好的免疫治疗试剂，而不考虑患者的Fe Y R多态性。[0484]使用培养的细胞系或来自患者的PMBC细胞通过ADCC测试根据本发明构建的双抗体分子以确定Fe突变增强ADCC的能力。使用本文公开的方法进行标准的ADCC。使用Ficoll-Paque梯度仪(Pharmacia)从外周血中收集淋巴细胞。对祀细胞，即培养的细胞系或来自患者的细胞加载铕(PerkinElmer)并在37°C下与效应子孵育4小时。使用荧光读板机(Wallac)检测所释放的铕。所得的ADCC数据表明本发明的分子激发NK细胞介导的细胞毒性的功效并确定哪些分子可用患者样品和淘析的单核细胞测试。然后在ADCC测定中使用来自患者的PBMC测试表现出弓I发ADCC活性的最大潜力的双抗体分子。来自健康供体的PBMC用作效应细胞。[0485]因此，本发明提供了预防或治疗以癌症抗原为特征的癌症的方法，通过根据本发明构建免疫特异性地识别所述癌症抗原的双抗体分子，使得该双抗体分子本身是有细胞毒性的(例如，通过表面受体的交联，导致凋亡增加或增殖信号下调)和/或包含Fe结构域，和/或介导一种或多种效应功能(例如，ADCC、吞噬作用)。已根据本发明构建的双抗体对于预防或治疗癌症是有用的，因为其具有细胞毒性活性(例如，增加的对肿瘤细胞的杀伤和/或例如，增强的ADCC活性或CDC活性)。[0486]与癌症抗原有关的癌症可通过施用双抗体来治疗或预防，所述双抗体结合癌症抗原且是有细胞毒性的，和/或已被根据本发明的方法构建为显示效应功能。例如，而非限制性地，与以下癌症抗原有关的癌症可通过本发明的方法和组合物治疗或预防。KS1/4泛癌抗原(Perez 等人(1989) “Isolation And Characterization Of A Cdna Encoding TheKsl/4Epithelial Carcinoma Marker, ”J.1mmunol.142:3662-3667 ； Moller 等人(1991)“Bispecific-Monoclonal-Antibody-Directed Lysis Of Ovarian Carcinoma Cells ByActivated Human T Lymphocytes,，，Cancer Tmmunol.1mmunother.33(4):210-216)、卵巢癌抗原(CA125) (Yu 等人(1991) 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Adhesion-ModulatingProperty,，，Trends in Biochem.Sc1.17:359-363)、恶性人淋巴细胞抗原-AP0-1 (Trauth等人(1989) “Monoclonal Antibody-Mediated Tumor Regression By InductionOf Apoptosis,，，Science245:301-304)、分化抗原(Feizi (1985) “Demonstration ByMonoclonal Antibodies That Carbohydrate Structures Of Glycoproteins AndGlycolipids Are Onco-Developmental Antigens,，，Nature314:53-57)例如在胚胎红细胞和原内胚层中发现的I抗原、在胃腺癌中发现的I (Ma)、在乳腺上皮中发现的M18和M39、在骨髓细胞中发现的SSEA-1、在结肠直肠癌中发现的VEP8、VEP9、Myl、VM-D5和DA6-22、TRA-1-85 (血型H)、在结肠腺癌中发现的C14、在肺腺癌中发现的F3、在胃癌中发现的AH6、Y半抗原、在胚胎性癌细胞中发现的Ley、TL5 (血型A)、在A431细胞中发现的EGF受体、在胰腺癌中发现的E1系列(血型B)、在胚胎性癌细胞、胃腺癌中发现的FC10.2、在腺癌中发现的C0-514 (血型Lea)、在腺癌中发现的NS-10、在结肠腺癌中发现的C0-43 (血型Leb)、G49、EGF受体(血型ALeb/Ley)、在结肠癌中发现的19.9、胃癌黏蛋白、在骨髓细胞中发现的T5A7、在黑色素瘤中发现的R24、在胚胎性癌细胞中发现的4.2、Gra> Dl.1、OFA-1、GM2、OFA-2、GD2、Ml:22:25:8以及在4-8-细胞阶段的胚胎中发现的SSEA-3、SSEA-4。在另一个实施方式中，抗原是来自皮肤T细胞淋巴瘤的T细胞受体衍生的肽(参见Edelson(1998) “CutaneousT-Cell Lymphoma:A Model For Selective Immunotherapy,^Cancer J Sci Am.4:62-71)。[0487]可通过本发明的方法和组合物治疗或预防的癌症和相关疾患包括但不限于下列:白血病,包括但不限于急性白血病、 急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病例如成髓细胞白血病、早幼粒细胞白血病、骨髓单核细胞白血病、单核细胞白血病、红白血病和骨髓增生异常综合征、慢性白血病例如但不限于慢性髓细胞(粒细胞)白血病、慢性淋巴细胞白血病、毛细胞白血病；真性红细胞增多症；淋巴瘤，例如但不限于霍奇金病、非霍奇金病；多发性骨髓瘤例如但不限于郁积型多发性骨髓瘤、非分泌型骨髓瘤、骨硬化性骨髓瘤、浆细胞白血病、孤立性浆细胞瘤和髓外浆细胞瘤；瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症；影响未定的单克隆丙种球蛋白病；良性单克隆丙种球蛋白病；重链病；骨骼和结缔组织肉瘤例如但不限于骨肉瘤、成骨肉瘤、软骨肉瘤、尤文氏肉瘤、恶性巨细胞瘤、骨纤维肉瘤、脊索瘤、骨膜肉瘤、软组织肉瘤、血管肉瘤(血管内皮瘤)、纤维肉瘤、卡波西肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、淋巴管肉瘤、神经鞘膜瘤、横纹肌肉瘤、滑膜肉瘤；脑肿瘤，包括但不限于胶质瘤、星形细胞瘤、脑干胶质瘤、室管膜瘤、少突胶质细胞瘤、非胶质瘤、听神经瘤、颅咽管瘤、髓母细胞瘤、脑膜瘤、松果体细胞瘤、松果体母细胞瘤、原发脑淋巴瘤；乳腺癌，包括但不限于腺癌、小叶(小细胞)癌、导管内癌、乳腺髓样癌、粘液性乳腺癌、乳腺小管癌、乳头癌、佩吉特病，和炎性乳腺癌；肾上腺癌，包括但不限于嗜铬细胞瘤和肾上腺皮质癌；甲状腺癌，例如但不限于乳头状或滤泡状甲状腺癌、甲状腺髓样癌和甲状腺未分化癌；胰腺癌，包括但不限于胰岛素瘤、胃泌素瘤、胰高血糖素瘤、血管活性肠肽瘤、生长抑素分泌性肿瘤和良性肿瘤或胰岛细胞肿瘤；垂体癌，包括但不限于库欣病、催乳素分泌性肿瘤、肢端肥大症和尿崩症；眼癌，包括但不限于眼黑色素瘤例如虹膜黑色素瘤、脉络膜黑色素瘤和睫状体黑色素瘤和视网膜母细胞瘤；阴道癌，包括但不限于鳞状细胞癌、腺癌、和黑色素瘤；外阴癌包括但不限于鳞状细胞癌、黑色素瘤、腺癌、基底细胞癌、肉瘤、和佩吉特病；宫颈癌，包括但不限于鳞状细胞癌和腺癌；子宫癌，包括但不限于子宫内膜癌和子宫肉瘤；卵巢癌，包括但不限于卵巢上皮癌、交界性肿瘤、生殖细胞肿瘤和基质肿瘤；食管癌包括但不限于鳞状细胞癌、腺癌、腺样囊性癌、黏液表皮样癌、腺鳞癌、肉瘤、黑色素瘤、浆细胞瘤、疣状癌、和燕麦(小细胞)细胞癌；胃癌包括但不限于腺癌、真菌样生长(息肉样)、形成溃疡、浅表扩散、扩散性蔓延的恶性淋巴瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤和癌肉瘤；结肠癌；直肠癌；肝癌，包括但不限于肝细胞癌和肝母细胞瘤，胆囊癌包括但不限于腺癌；胆管癌包括但不限于乳头状、结节的和弥散的；肺癌包括但不限于非小细胞肺癌、鳞状细胞癌(表皮样癌)、腺癌、大细胞癌和小细胞肺癌；睾丸癌，包括但不限于胚组 织瘤、精原细胞瘤、退行发育的、经典的(典型)的、精母细胞性非精原细胞瘤、胚胎性癌、畸胎瘤癌、绒毛膜癌(卵黄囊肿瘤)，前列腺癌，包括但不限于腺癌、平滑肌肉瘤和横纹肌肉瘤；阴茎癌；口腔癌，包括但不限于鳞状细胞癌；基底癌；唾液腺癌症，包括但不限于腺癌、粘液表皮样癌和腺样囊性癌；咽癌，包括但不限于鳞状细胞癌和疣状癌；皮肤癌，包括但不限于基底细胞癌、鳞状细胞癌和黑色素瘤、表面扩散性黑色素瘤、结节性黑色素瘤、雀斑样恶性黑色素瘤、肢端雀斑样黑色素瘤；肾癌，包括但不限于，肾细胞癌、腺癌、肾上腺样瘤、纤维肉瘤、移行细胞癌(肾盂和/或输尿管(Uterer));维尔姆斯肿瘤；膀胱癌，包括但不限于移行细胞癌、鳞状细胞癌、腺癌、癌肉瘤。另外、癌症包括黏液肉瘤、成骨肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、间皮瘤、滑膜瘤、血管母细胞瘤、上皮癌、囊腺癌、支气管癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌和乳头状腺癌(对于这些疾患的综述，参见Fishman 等人(1985)Medicine, 2d Ed., J.B.Lippincott C0., Philadelphia ;和 Murphy 等人(1997)Informed Decisions:The Complete Book of Cancer Diagnosis,Treatment,andRecovery, Viking Penguin, Penguin Books U.S.A., Inc., United States of America)。[0488]因此，本发明的方法和组合物在治疗和预防包括(但不限于)下列的各种癌症或其他异常增生性疾病中也是有用的:癌，包括膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、肾癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、前列腺癌、宫颈癌、甲状腺癌和皮肤癌；包括鳞状细胞癌；造血性淋巴系肿瘤，包括白血病、急性淋巴细胞白血病、急性成淋巴细胞白血病、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤(Burketts lymphoma);造血性髓系肿瘤，包括急性和慢性骨髓白血病和早幼粒细胞白血病；间充质来源的肿瘤，包括纤维肉瘤和横纹肌肉瘤；其他肿瘤，包括黑色素瘤、精原细胞瘤、畸胎癌、神经母细胞瘤和胶质瘤；中枢和外周神经系统的肿瘤，包括星形细胞瘤、神经母细胞瘤、胶质瘤和施旺细胞瘤；间充质来源的肿瘤，包括纤维肉瘤、横纹肌肉瘤和成骨肉瘤；及其他肿瘤，包括黑色素瘤、着色性干皮病、角化棘皮瘤、精原细胞瘤、甲状腺滤泡癌和畸胎瘤。还设想了由凋亡中的畸变引起的癌症也将通过本发明的方法和组合物治疗。这些癌症可包括但不限于滤泡性淋巴瘤、具有P53突变的癌、乳腺、前列腺癌和卵巢的激素依赖性肿瘤和癌前病变，例如家族性腺瘤性息肉和骨髓增生异常综合征。在特定实施方式中，通过本发明的方法和组合物治疗或预防卵巢、膀胱、乳腺、结肠、肺、皮肤、胰或子宫中的恶性肿瘤或异常增生变化(例如，组织转化和发育异常)或高度增生性疾患。在其他特定实施方式中，通过本发明的方法和组合物治疗肉瘤、黑色素瘤或白血病。[0489]在特定实施方式中，相对于癌细胞在无本发明的分子存在下的生长，本发明的分子(例如，包含多个表位结合结构域和任选地，Fe结构域(或其部分)的双抗体)将癌细胞的生长抑制或减少至少99%、至少95%、至少90%、至少85%、至少80%、至少75%、至少70%、至少60%、至少50%、至少45%、至少40%、至少45%、至少35%、至少30%、至少25%、至少20%或至少10%。[0490]在特定实施方式中，本发明的分子(例如，包含多个表位结合结构域和任选地，Fe结构域(或其部分)的双抗体)比亲本分子更好地杀伤细胞或将癌细胞生长抑制或减少至少5%、至少10%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少100%。[0491]5.6.2自身免疫病和炎性疾病[0492]在某些实施方式中，本发明的分子包含根据本发明的方法构建的对Fe Y RIIB特异性的表位结合结构域和/或变体Fe结构域(或其部分)，所述Fe结构域相对于野生型Fe结构域表现出对Fe Y RIIB更大的亲和力和对Fe Y RIIIA和/或Fe Y RIIA减小的亲和力。具有这些结合特征的本发明的分子在调控免疫反应，例如在抑制与自身免疫病或炎性疾病有关的免疫反应方面是有用的。虽然不期望被任何作用机制所束缚，但是具有对Fe Y RIIB的亲和力和/或包含具有增加的对Fe Y RIIB的亲和力和减少的对Fe Y RIIIA和/或Fe Y RIIA的亲和力的Fe结构域的本发明的分子可导致减弱对Fe Y R的活化反应并抑制细胞反应性，且因此对于治疗和/或预防自身免疫疾患具有治疗功效。[0493]本发明还提供可了用于预防、治疗或控制与受治疗者的炎性疾患有关的一种或多种症状的方法，该方法还包括对所述受治疗者施用治疗或预防有效量的一种或多种抗炎齐U。本发明还提供了用于预防、治疗或控制与受治疗者的自身免疫病有关的一种或多种症状的方法，该方法还包括对所述受治疗者施用治疗或预防有效量的一种或免疫调节剂。5.7节提供了抗炎剂和免疫调节剂的非限制性实例。[0494]可通过施用本发明的分子治疗的自身免疫疾患的实例包括但不限于斑秃、强直性脊柱炎、抗磷脂综合征、自身免疫性艾迪生病、肾上腺的自身免疫病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性卵巢炎和睾丸炎、自身免疫性血小板减少症、白塞病、大疱性类天疱疮、心肌病、乳糜泻性皮炎、慢性疲劳免疫功能疾患综合征(CFIDS)、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病、Churg-Strauss综合征、瘢痕性类天疱疮、CREST综合征、冷凝集素病、克罗恩病、盘状红斑、特发性混合型冷球蛋白血症、纤维肌痛-肌纤维组织炎、肾小球肾炎、格雷夫斯病、格-巴二氏病(Guillain-Barre)、桥本甲状腺炎、特发性肺纤维化、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、IgA神经病变、幼年型关节炎、扁平苔藓、红斑狼疮、梅尼尔病、混合性结缔组织病、多发性硬化、I型糖尿病或免疫介导的糖尿病、重症肌无力、寻常型天疱疮、恶性贫血、结节性多动脉炎、多软骨炎、多腺体综合征、风湿性多肌痛、多发性肌炎和皮肌炎、原发性丙种球蛋白缺乏症、原发性胆汁性肝硬化、银屑病、银屑病关节炎、雷诺现象、瑞特综合征、类风湿关节炎、结节病、硬皮病、综合征、僵人综合征、系统性红斑狼疮、红斑狼疮、多发性大动脉炎、颞动脉炎/巨细胞动脉炎、溃疡性结肠炎、葡萄膜炎、血管炎(vasculitides)例如疱疫样皮炎、脉管炎(vasculitis)、白癜风和韦格纳肉芽肿。炎性疾患的实例包括但不限于哮喘、脑炎、炎性肠病、慢性阻塞性肺病(COPD)、过敏性疾患、感染性休克、肺纤维化、未分化脊柱关节病、未分化关节病、关节炎、炎性骨溶解症以及由慢性病毒或细菌感染而导致的慢性炎症。如本文在2.2.2节描述的，某些自身免疫疾患与炎性病症有关。因此，在被认为是自身免疫疾患和炎性疾患之间存在重叠。因此，某些自身免疫疾患还可被表征为炎性疾患。根据本发明的方法可预防、治疗或控制的炎性疾患的实例包括但不限于哮喘、脑炎、炎性肠病、慢性阻塞性肺病(COPD)、过敏性疾患、感染性休克、肺纤维化、未分化脊柱关节病、未分化关节病、关节炎、炎性骨溶解以及由慢性病毒或细菌感染而导致的慢性炎症。[0495]包含对FcyRIIB特异性的至少一个表位结合结构域和/或具有增强的对FcyRIIB的亲和力和减少的对Fe Y RIIIA的亲和力的变体Fe结构域的本发明的分子还可用来减轻患炎性疾患的动物，特别是哺乳动物所经历的炎症。在特定实施方式中，相对于未被施用本发明的分子的动物的炎症，所述分子将所述动物的炎症减少至少99%、至少95%、至少90%、至少85%、至少80%、至少75%、至少70%、至少60%、至少50%、至少45%、至少40%、至少45%、至少35%、至少30%、至少25%、至少20%或至少10%。[0496]包含对FcyRIIB特异性的至少一个表位结合结构域和/或具有增强的对Fe Y RIIB的亲和力和减少的对Fe YRIIIA的亲和力的变体Fe结构域的本发明的分子还可用来防止排斥移植物。[0497]5.6.3 传染病[0498]本发明还包括用于治疗或预防受治疗者的传染病的方法，包括施用治疗或预防有效量的包含对与所述传染病相关的传染原特异性的至少一个表位结合结构域的一种或多种本发明的分子。在某些实施方式中，相对于无本发明的分子存在下的免疫反应，所述分子对于所述传染原是毒性的，增强针对所述物质的免疫反应或增强针对所述传染原的效应功能。本发明的分子可治疗或预防的传染病是由传染原，包括但不限于病毒、细菌、真菌、原生动物和病毒引起的。[0499]可使用本发明的分子结合本发明的方法治疗或预防的病毒性疾病包括但不限于由甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、流感病毒、水痘病毒、腺病毒、单纯疱疹病毒I型(HSV-1)、单纯疱疫病毒II型(HSV-1I)、牛痕病毒、鼻病毒、埃可病毒、轮状病毒、呼吸道合胞病毒、乳头瘤病毒、乳多空病毒、巨细胞病毒、埃可病毒、虫媒病毒、汉坦病毒、柯萨奇病毒、流行性腮腺炎病毒、麻疹病毒、风疹病毒、脊髓灰质炎病毒、天花、埃巴病毒(Epstein Barr virus)、I型人免疫缺陷病毒(HIV-1)、II型人免疫缺陷病毒(HIV-1I)、和病毒性疾病例如病毒性脑膜炎、脑炎、登革热或天花的病原体引起的病毒性疾病。[0500]可使用本发明的分子结合本发明的方法治疗或预防由细菌引起的细菌性疾病，所述细菌包括但不限于分枝杆菌、立克次氏体、支原体、奈瑟氏球菌(neisseria)、肺炎链球菌(S.pneumonia)、伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)(莱姆病)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)(炭疽)、破伤风、链球菌(streptococcus)、葡萄球菌(staphylococcus)、分枝杆菌(mycobacterium)、破伤风、百日咳、霍乱、痕疫、白喉、衣原体、金黄色葡萄球菌(S.aureus)和军团菌(Iegionella)。[0501]可使用本发明的分子结合本发明的方法治疗或预防的由原生动物引起的原生动物病包括但不限于，利什曼原虫病、球虫病、锥虫病或疟疾。[0502]可使用本发明的分子结合本发明的方法治疗或预防的由寄生虫引起的寄生虫病包括但不限于，衣原体和立克 次氏体。[0503]根据本发明的一个方面，包含对传染原特异性的至少一个表位结合结构域的本发明的分子对所述传染原例如，致病蛋白质表现出抗体效应功能。传染原的实例包括但不限于细菌(例如，大肠杆菌、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌(Enterococcus faecials)、白色念珠菌(Candida albicans)、变形杆菌(Proteusvulgaris)、绿色葡萄球菌(Staphylococcus viridans)和铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa))，病原体(例如，B嗜淋巴细胞乳多空病毒(LPV);百日咳杆菌(Bordatellapertussis);博尔纳病病毒(BDV);牛冠状病毒；脉络丛脑膜炎病毒；登革热病毒；病毒,大肠杆菌；埃博拉病毒；埃可病毒-1 ;埃柯病毒-1l(EV);内毒素(LPS);肠细菌；肠孤儿病毒；肠病毒；猫白血病病毒；口蹄疫病毒；长臂猿白血病病毒(GALV);革兰氏阴性菌；幽门螺杆菌；乙型肝炎病毒(HBV);单纯疱疹病毒；HIV-1 ;人巨细胞病毒；人冠状病毒；甲、乙和丙型流感；军团菌；墨西哥利什曼原虫；单核细胞增生利斯特氏菌(Listeria monocytogenes)；麻疫病毒(Measles virus);脑膜炎球菌；麻疫病毒(Morbillivirus);小鼠肝炎病毒；鼠白血病病毒；鼠Y疱疫病毒；鼠逆转录病毒；鼠冠状病毒；小鼠肝炎病毒；鸟分枝杆菌-M (Mycobacterium avium-M);淋病奈瑟氏球菌；纽卡斯尔病病毒；细小病毒B19 ;恶性痕原虫；痘病毒；假单胞菌；轮状病毒；鼠伤寒沙门氏菌；志贺氏菌属(Shigella);链球菌属(Streptococci) ；T细胞嗜淋巴细胞病毒I ;牛痘病毒)。[0504]5.6.4解毒作用[0505]本发明还包对被暴露于毒素(例如，毒性药物分子)的受治疗者解毒的方法，包括施用治疗或预防有效量的包含对所述毒性药物分子特异性的至少一个表位结合结构域的一种或多种本发明的分子。在某些实施方式中，本发明的分子与所述毒素结合减少或消除了所述毒素的不利生理作用。又在其他实施方式中，本发明的双抗体与所述毒素的结合相对于无所述双抗体存在下的消除、降解或中和增加或增强了对所述毒素的消除、降解或中和。根据本发明的方法的免疫毒性协同疗法可用来治疗对包括但不限于地高辛、PCP、可卡因、秋水仙碱以及三环抗抑郁药用药过多或对其的暴露。[0506]5.7组合治疗[0507]本发明还包括施用与本领域技术人员已知的用于治疗或预防癌症、自身免疫病、传染病或中毒的其他治疗，包括但不限于当前的标准化疗和实验性化疗、激素治疗、生物治疗、免疫治疗、放射治疗或手术组合的本发明的分子。在某些实施方式中，本发明的分子可与治疗或预防有效量的本领域技术 人员已知的用于治疗和/或预防癌症、自身免疫病、传染病或中毒的一种或多种剂、治疗性抗体或其他剂组合施用。[0508]在某些实施方式中，一种或多种本发明的分子与对治疗癌症有用的一种或多种其他治疗剂被同时施用给哺乳动物，优选地人。术语“同时地”不限于在完全相同的时间施用预防或治疗剂，而是意味着本发明的分子和其他剂被顺序性地且在某个时间间隔内施用给哺乳动物，使得本发明的分子可与所述其他剂一起起到提供比如果它们被以其他方式施用时增加的益处。例如，每种预防或治疗剂(例如，化疗、放射治疗、激素治疗或生物治疗)可同时施用或在不同的时间点顺序性地以任何顺序施用；但是，如果不同时施用的话，其被施用的时间应足够接近以提供期望的治疗或预防效果。每种治疗剂可单独地、以任何合适的形式和通过任何适合的途径施用。在多种实施方式中，所述预防或治疗剂被以间隔小于I小时，间隔约I小时，间隔约I小时至约2小时，间隔约2小时至约3小时，间隔约3小时至约4小时，间隔约4小时至约5小时，间隔约5小时至约6小时，间隔约6小时至约7小时，间隔约7小时至约8小时，间隔约8小时至约9小时，间隔约9小时至约10小时，间隔约10小时至约11小时，间隔约11小时至约12小时，间隔不大于24小时，或间隔不大于48小时地施用。在优选的实施方式中，在患者同一次就诊时施用两种或更多种组分。[0509]在其他实施方式中，预防或治疗剂被以间隔约2至4天、间隔约4至6天、间隔约I周、间隔约I至2周或间隔不大于2周地施用。在优选的实施方式中，预防或治疗剂在其中两种剂仍都有活性的时间范围内施用。本领域技术人员将能够通过确定所施用的剂的半衰期来确定该时间范围。[0510]在某些实施方式中，本发明的预防或治疗剂被周期性地施用给受治疗者。周期性治疗包括施用第一剂持续一段时间，接下来施用第二剂和/或第三剂持续一段时间并重复该顺序性施用。周期性治疗可减少对一种或多种治疗的抗性的发展，避免或减少治疗之一的副作用，和/或提高治疗功效。[0511]在某些实施方式中，以小于约3周、约每两周一次、约每10天一次或约每周一次的周期施用预防或治疗剂。一个周期可包含通过每个周期约90分钟，每个周期约I小时，每个周期约45分钟内的输注施用治疗或预防剂。每个周期可包含静止至少I周、静止至少2周、静止至少3周。所施用的周期的数目为从约I至约12个周期，更通常地约2至约10个周期，且更通常地约2至约8个周期。[0512]又在其他实施方式中，本发明的治疗和预防剂以有规律的给药方案通过没有延长的静止期的连续输注或频繁施用而被施用。该有规律的施用可包括以没有静止期的恒定的间隔给药。通常，治疗剂特别是细胞毒性剂以较低的剂量使用。这些用药方案包括长期的每天施用相对低剂量，持续延长的时期。在优选的实施方式中，使用较低剂量可最小化毒性副作用并消除静止期。在某些实施方式中，治疗和预防剂通过从约24小时至约2天、至约I周、至约2周、至约3周、至约I个月、至约2个月、至约3个月、至约4个月、至约5个月、至约6个月范围内的长期的低剂量或连续输注递送。熟练的肿瘤学家可优化该用药方案的时间安排。[0513]在其他实施方式中，同时对哺乳动物施用多个疗程，即，分别地但仍在一定时间间隔内施用单次剂量的治疗剂，使得本发明的分子可与一种或多种其他剂一起发挥作用。例如，每周一次的一种 组分可与可每两周一次或每三周一次地施用的其他组分组合施用。换句话说，即使未同时或在患者同一次就诊时施用治疗剂，也并行地执行该治疗剂的给药方案。[0514]当与其他预防和/或治疗剂组合使用时，本发明的分子和所述预防和/或治疗剂可加和地或更优选地，协同地起作用。在一个实施方式中，本发明的分子与一种或多种治疗剂在同一药物组合物中并行施用。在另一个实施方式中，本发明的分子与一种或多种其他治疗剂在不同的药物组合物中并行施用。又在另一个实施方式中，本发明的分子在施用另一种治疗或预防剂之前或之后施用。本发明设想了通过相同或不同的施用途径，例如，经口服和肠胃外与其他预防或治疗剂组合施用本发明的分子。在某些实施方式中，当本发明的分子与可能产生包括但不限于毒性的副作用的另一种预防或治疗剂并行施用时，可以以下降到引发副作用的阈值以下的剂量有利地施用所述预防或治疗剂。[0515]本文提供的用药量和施用频率被术语治疗有效和预防有效所包括。取决于所施用的特定治疗或预防剂、癌症的严重度和类型、施用途径、以及年龄、体重、患者的反应和过往的医疗史，所述剂量和频率通常还将根据每个患者所特有的因素变化。本领域技术人员可通过考虎这些因素并通过遵循例如在文献中报道以及Physician’ s Desk Reference (第56版，2002)中推荐的剂量来选择合适的方案。[0516]5.7.1 抗癌剂[0517]在特定实施方式中，本发明的方法包括与用于治疗和/或预防癌症的一种或多种治疗剂一起施用一种或多种本发明的分子。在一个实施方式中，血管生成抑制剂可与本发明的分子组合施用。可用于本发明的方法和组合物中的血管生成抑制剂包括但不限于下列:制管张素(纤溶酶原片段)；抗血管生成抗凝血酶III ；Angiozyme ；ABT-627 ；Bayl2-9566 ;倍尼芬；贝伐珠单抗;BMS_275291 ;软骨来源的抑制剂(CDI) ；CAI ;CD59补体片段；CEP-7055 ;Col3 ;康普立停A-4 ;内皮抑制素(胶原XVIII片段)；纤连蛋白片段；Gro-β ;卤夫酮；肝素酶；肝素六糖片段；HMV833 ;人绒毛膜促性腺激素(hCG) ；IM-862 ；干扰素α/β/γ ;干扰素诱导蛋白(IP-1O);白介素-12 ;Kringle5(纤溶酶原片段)；马立马司他；金属蛋白酶抑制剂(ΊΊΜΡ) ;2-甲氧基雌二醇；MMI270(CGS27023A) ；MoAbIMC-1Cll ;新伐司他；NM-3 ；Panzem ;PI_88 ;胎盘核糖核酸酶抑制剂；纤溶酶原活化剂抑制剂；血小板因子_4(PF4);普马司他；催乳素16kDa片段；增殖蛋白-相关蛋白(PRP)；PTK787/ZK222594 ;类视黄醇；索利司他；角鲨胺；SS3304 ；SU5416 ；SU6668 ；SU11248 ；四氢皮质醇-S ;四硫钥酸盐；萨力多胺；血小板反应蛋白-1(TSP-1) ；TNP-470 ;转化生长因子-β (TGF-b) ；Vasculostatin ;Vasostatin(I丐网蛋白片段)；ZD6126 ;ZD6474 ;法呢基转移酶抑制剂(FTI);以及二膦酸盐。[0518]可与本发明的分子在本发明的多个实施方式，包括本发明的药物组合物和剂型和药盒中组合使用的抗癌剂包括但不限于:阿西维辛；阿柔比星；盐酸阿考达唑；阿克罗宁；阿多来新；阿地白介素；六甲蜜胺；安波霉素；醋酸阿美坦醌；氨鲁米特；安吖啶；阿那曲唑；氨茴霉素；天冬酰胺酶；阿司匹林；阿扎胞苷；阿扎替派；阿佐霉素；巴马司他；苄替哌；比卡鲁胺；盐酸比生群；双萘法德二甲磺酸盐；比折来新；硫酸博莱霉素；布喹那钠；溴匹立明；白消安；放线菌素C ;卡普睾酮；卡醋胺；卡贝替姆；卡钼；卡莫司汀；盐酸卡柔比星；卡折来新；西地芬戈；苯丁酸氮芥；西罗霉素；顺钼；克拉屈滨；甲磺酸克立那托；环磷酰胺；阿糖胞苷；达卡巴嗪；平阳霉素；盐酸柔红霉素；地西他滨；右奥马钼；地扎呱宁；甲磺酸地扎呱宁；地吖醌；多西紫杉醇；阿霉素；盐酸阿霉素；屈洛昔芬；柠檬酸屈洛昔芬；屈他椎酮丙酸酯；达佐霉素 ；依达曲沙；盐酸依氟鸟氨酸；依沙芦星；恩洛钼；恩普氨酯；依匹哌啶；盐酸表柔比星；厄布洛唑；盐酸依索比星；雌氮芥；雌氮芥磷酸钠；依他硝唑；依托泊苷；磷酸依托泊苷；艾托卜宁；盐酸法倔唑；法扎拉滨；维甲酰酚胺；氟尿苷；磷酸氟达拉滨；氟尿嘧啶；氟西他滨；磷喹酮；福司曲星钠；吉西他滨；盐酸吉西他滨；羟基脲；盐酸伊达比星；异环磷酰胺；伊莫福新；白介素II (包括重组白介素II或rIL2)、干扰素α -2a ;干扰素a -2b ;干扰素a -nl ;干扰素α -η3 ;干扰素β -1a ;干扰素Y -1b ;异丙钼；盐酸伊立替康；醋酸兰瑞肽；来曲唑；醋酸亮丙瑞林；盐酸利阿罗唑；洛美曲索钠；洛莫司汀；盐酸洛索蒽醌；马索罗酚；美登素；盐酸氮芥；醋酸甲地孕酮；醋酸美仑孕酮；美法仑；美诺立尔；巯嘌呤；甲氨蝶呤；甲氨蝶呤钠；氯苯氨唳(metoprine);美妥替哌；米丁度胺；米托卡星；丝裂红素；米托洁林；米托马星；丝裂霉素；米托司培；米托坦；盐酸米托蒽醌；霉酚酸；诺考达唑；诺加霉素；奥马钼；亚磺酰吡啶；紫杉醇；培门冬酶；培利霉素；戊氮芥；硫酸培洛霉素；培磷酰胺；哌泊溴烷；嗪消安；盐酸吡罗蒽醌；普卡霉素；普洛美坦；卟非尔钠；泊非霉素；泼尼氮芥；盐酸丙卡巴肼；嘌呤霉素；盐酸嘌呤霉素；吡唑呋喃菌素；利波腺苷；罗谷亚胺；沙芬戈；盐酸沙芬戈；司莫司汀；辛曲秦；磷乙酰天冬氨酸钠(sparfosate sodium)；稀疏霉素；盐酸螺旋锗；螺莫司汀；螺钼；链黑菌素；链脲菌素；磺氯苯脲；泰莱霉索(talisomycin);替可加兰钠；替加氟；盐酸替洛蒽醌；替莫泊芬；替尼泊苷；替罗昔隆；睾内酯；硝咪硫鸟嘌呤(thiamiprine);硫鸟嘌呤；噻替哌；噻唑呋林；替拉扎明；柠檬酸托瑞米芬；醋酸曲托龙；磷酸曲西立滨；三甲曲沙；葡萄糖醛酸三甲曲沙；曲普瑞林；盐酸九布洛唑；尿喃唳氮芥(uracil mustard);乌瑞替哌；伐普肽；维替泊芬；硫酸长春花碱；硫酸长春新喊；长春地羊；硫酸长春地羊；硫酸长春匹定；硫酸长春甘酷；喊硫长春罗新；酒石酸长春瑞滨；硫酸异长春碱；硫酸长春利定；伏氯唑；折尼钼；净司他汀(zinostatin);盐酸佐柔比星。其他抗癌药物包括但不限于:20-差向异构-1，25- 二羟基维生素D3 ；5-乙炔基尿嘧啶；阿比特龙；阿柔比星；酰基富烯；腺环戊醇；阿多来新；白介素；ALL-TK拮抗剂；六甲蜜胺；桉巴氮芥；amidoX ;氨磷汀；氨基乙酰丙酸；氨柔比星；安吖啶；阿那格雷；阿那曲唑；穿心莲内酯；血管生成抑制剂；拮抗剂D ;拮抗剂G ;安雷利克斯(antarelix);抗-背部形态发生蛋白-1 ;抗雄激素物质，前列腺癌；抗雌激素；抗瘤酮；反义寡核苷酸；阿非迪霉素甘氨酸酯；凋亡基因调节剂；凋亡调控因子；脱嘌呤核酸；阿糖胞苷-cdp-dl-ptba ；精氨酸脱氨酶；asulacrine ;阿他美坦；阿莫司汀；axinastatinl ；axinastatin2 ；axinastatin3 ;阿扎司琼；阿扎毒素(azatoxin);氮杂酪氨酸；巴卡亭III衍生物；balanol ;巴马司他；BCR/ABL拮抗剂；苯并二氢B卜吩；苯甲酰星孢菌素；β _内酰胺衍生物；β -alethine ； β克拉霉素B ;桦木酸；bFGF抑制剂；比卡鲁胺；比生群；双氮杂环丙烯基精胺；双萘法德；双枸橼酸环己噻卓酯A(bistratene A);比折来新；breflate ;溴匹立明；布朵替坦；丁硫氨酸亚砜胺；卡泊三醇；钙感光蛋白C(Calphostin C);喜树碱衍生物；金丝雀痘IL-2 ;卡培他滨；甲酰胺-氨基-三唑；羧胺三唑；CaRest M3 ；CARN700 ;软骨衍生的抑制剂；卡折来新；酪蛋白激酶抑制剂(ICOS);栗树精胺；抗菌肽B ;西曲瑞克；chlorlns ；氯代喹喔啉磺酰胺；西卡前列素；顺式卟啉；克拉屈滨；氯米芬类似物；克霉唑；柯林斯霉菌素A ;柯林斯霉菌素B ;康普立停A4 ;康普立停类似物；conagenin ； crambescidin816 ；克立那托(crisnatol) ；cryptophycin8 ；cryptophycin A 衍生物；curacin A ;环戍蒽醌;cycloplatam ；cypemycin ;阿糖胞苷烧磷酯；细胞裂解因子；磷酸己烧雌酹(cytostatin)；达昔单抗；地西他滨；dehydrodidemnin B ;地洛瑞林；地塞米松；右异环磷酰胺；右丙亚胺；右维拉帕米；亚丝醌；代代宁B(Didemnin B) ;didox ;二乙基正精胺；二氢-5-氮杂胞苷；9_ 二氢紫杉醇；dioxamycin ;二苯螺莫司汀；多西他赛；二十二醇；多拉司琼；去氧氟尿苷；屈洛昔芬；屈大麻酹；duocarmycin SA ;依布硒；依考莫司汀；依地福新；依决洛单抗；依氟鸟氨酸；榄香烯；乙嘧替氟；表柔比星；爱普列特；雌氮芥类似物；雌激素激动剂；雌激素拮抗剂；依他硝唑；磷酸依托泊苷；依西美坦；法倔唑；法扎拉滨；维甲酰酚胺；非格司亭；非那雄胺；flavopiridol ;氟卓斯汀；fluasterone ;氟达拉滨；盐酸氟代柔红霉素；福酹美克；福美坦；福司曲星；福莫司汀；礼替沙林(gadolinium texaphyrin);硝酸镓；力口洛他滨；加尼瑞克；明胶酶抑制剂；吉西他滨；谷胱甘肽抑制剂；hepsulfam ;调蛋白；六亚甲基二乙酰胺；金丝桃素；伊班膦酸；伊达比星；艾多昔芬；伊决孟酮；伊莫费新；伊洛马司他；咪唑并吖啶酮；咪喹莫特；免疫刺激肽；胰岛素样生长因子-1受体抑制剂；干扰素激动剂；干扰素；白介素；碘苄胍；碘阿霉素；4_甘薯醇；伊罗普拉；伊索拉定；iS0bengaZ0le ；isohom*ohalicondrin B ;伊他司琼；jasplakinolide ；kahalalide F ;片螺素-N 三乙酸酉旨；兰瑞肽；leinamycin ;来格司亭；硫酸香燕多糖；leptolstatin ;来曲唑；白血病抑制因子；白细胞α干扰素；亮丙瑞林+雌激素+孕酮；亮丙瑞林；左旋咪唑；利阿唑；线性多胺类似物；亲脂性二糖肽；亲脂性钼化合物；lissoclinamide7 ;洛钼；艇蝴磷脂；洛美曲索；氯尼达明；洛索蒽醌；洛伐他汀；洛索立宾；勒托替康；镥替沙林(lutetium texaphyrin)；Iysofylline ;裂解肽；美坦辛；mannostatin A ;马立马司他；马索罗酹；乳腺丝抑蛋白；基质裂解蛋白抑制剂；基质金属蛋白酶抑制剂；美诺立尔；merbarone ;美替瑞林；蛋氨酸酶；甲氧氯普胺；MIF抑制剂；米非司酮；米替福新；米立司亭；错配的双链RNA ;丙脒腙；二溴卫矛醇；丝裂霉素类似物；米托萘胺；米托毒素成纤维细胞生长因子-皂草素；米托蒽醌；莫法罗汀；莫拉司亭；单克隆抗体，人绒毛膜促性腺激素；单磷酸类脂A+分枝杆菌细胞壁的sk ;单哌潘生丁 ；多药耐药基因抑制剂；基于多肿瘤抑制基因I的治疗；芥子抗癌剂；mycaperoxide B ;分枝杆菌细胞壁提取物；myriaporone ；N-乙酰地那林；N_取代的苯甲酰胺；那法瑞林；那瑞替喷；纳洛酮+喷他佐辛；napavin ；naphterpin ;那托司亭；奈达钼；奈莫柔比星；奈立膦酸；中性内肽酶；尼鲁米特；nisamycin 氧化氮调节剂；一氧化二氮抗氧化剂；nitrullyn ;06_节基鸟嘌呤；奥曲肽；okicenone ;寡核苷酸；奥那司酮；奥坦西隆；奥坦西隆；oracin ; 口腔细胞因子诱导剂；奥马钼；奥沙特隆；奥沙利钼；oxaunomycin ;紫杉醇；紫杉醇类似物；紫杉醇衍生物；palauamine ;棕榈酰基根霉素；帕米膦酸；人参三醇；帕诺米芬；parabactin ;帕折普汀；培门冬酶；培得星；戍聚糖聚硫酸钠；喷司他丁 ；pentrozole ;全氟溴烧；过磷酰胺；紫苏醇；phenazinomycin ;乙酸苯酯；磷酸酶抑制剂；picibanil ;盐酸毛果芸香碱；卩比柔比星；卩比曲克辛；placetin A ；placetinB ;纤溶酶原活化剂抑制剂；钼络合物；钼化合物；钼-三胺络合物；卟非尔钠；泊非霉素；泼尼松；丙二 -吖啶酮；前列腺素J2 ;蛋白酶抑制剂；基于蛋白A的免疫调节剂；蛋白激酶C抑制剂；微藻蛋白激酶C抑制剂；蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂；嘌呤核苷磷酸化酶抑制剂；红紫素；吡唑啉吖啶；吡哆酰基化血红蛋白聚氧乙烯偶联物；raf拮抗剂；雷替曲塞；雷莫司琼；ras法尼基 蛋白转移酶抑制剂；ras抑制剂；ras_GAP抑制剂；去甲基化的瑞替普汀；轻乙膦酸铼Rel86 ;根霉素；核酶；RII维甲酰酹胺；罗谷亚胺；rohitukine ;罗莫肽；罗喹美克；rubiginone BI ；ruboxyl ;沙芬戈；saintopin ；SarCNU ；sarcophytol A ;沙格司亭；Sdil模拟物；司莫司汀；衰老衍生抑制剂I ;有义寡核苷酸；信号转导抑制剂；信号转导调节剂；单链抗原结合蛋白；西佐喃；索布佐生；硼卡钠；乙酸苯酯钠；solverol ;促生长因子结合蛋白；索纳明；膦门冬酸；spicamycin D ;螺莫司汀；splenopentin ;海绵素(spongistatin) I ;角藍胺；干细胞抑制剂；干细胞分裂抑制剂；stipiamide ;基质裂解蛋白抑制剂；sulfinosine ;强效的血管活性肠肽受体拮抗剂；suradista ;苏拉明；苦马豆碱；合成的糖胺聚糖；他莫司汀；三苯氧胺甲碘化物；牛磺莫司汀；他扎罗汀；替可加兰钠；替加氟；tellurapyrylium ;端粒酶抑制剂；替莫泊芬；替莫唑胺；替尼泊苷；四氯十氧化物；tetrazomine ；thaliblastine ;噻可拉林；血小板生成素；血小板生成素模拟物；胸腺法新；胸腺生成素受体激动剂；胸腺曲南；促甲状腺激素；本紫红素乙酯锡；替拉扎明；二氯化换戍二烯钛；topsentin ;托瑞米芬；全能干细胞因子；翻译抑制剂；维甲酸；三乙酰尿苷；曲西立滨；三甲曲沙；曲普瑞林；托吡西隆；妥罗雄脲；酪氨酸激酶抑制剂；tyrph0stin ；UBC抑制剂；乌苯美司；泌尿生殖窦-来源的生长抑制因子；尿激酶受体拮抗剂；伐普肽；variolin B ;红细胞基因治疗的载体系统；维拉雷琐；藜芦明；verdin ;维替泊芬；长春瑞滨；vinxaltine ；vitaxin ;伏氯唑；扎诺特隆；折尼钼；亚节维C和净司他丁激动剂。优选的另外的抗癌药物是5-氟尿嘧啶和亚叶酸。[0519]可用于本发明的方法的治疗性抗体的实例包括但不限于为免疫抑制性的ZENAPAX® (达利珠单抗)(Roche Pharmaceuticals, Switzerland)、用于预防急性肾移植排斥的人源化的抗-CD25单克隆抗体；为鼠抗-17-1A细胞表面抗原IgG2a抗体的PANOREX™(Glaxo ffellcome/Centocor);为鼠抗独特型(GD3表位)IgG抗体的BEC2 (ImCloneSystem);为嵌合抗 EGFR IgG 抗体的 IMC-C225 (ImClone System);为人源化抗-ανβ3整联蛋白抗体的 VITAXIN™(Applied Molecular Evolution/Medlmmune);为人源化抗 _CD33IgG 抗体的 Smart M195 (Protein Design Lab/Kanebo);为人源化抗-CD22IgG 抗体的 LYMPHOCIDE™ (Immunomedics) ;ICM3 为人源化抗-1CAM3 抗体(ICOS Pharm) ； IDEC-114为灵长类化的抗-CD80抗体(IDEC Pharm/Mitsubishi) ;IDEC_131为人源化抗-CD40L抗体(IDEC/Eisai) ;IDEC_151为灵长类化的抗-CD4抗体(IDEC) ;IDEC_152为灵长类化的抗-CD23 抗体(IDEC/Seikagaku) ；SMART 抗-CD3 为人源化抗 _CD3IgG (Protein DesignLab) ;5G1.1为人源化抗-补体因子5(C5)抗体(Alexion Pharm) ;D2E7为人源化抗-TNF-α抗体(CAT/BASF) ;CDP870 为人源化抗-TNF-aFab 片段(Celltech) ;IDEC_151 为灵长类化的抗 _CD4IgGl 抗体(IDEC Pharm/SmithKline Beecham) ;MDX_CD4 为人抗 _CD4IgG 抗体(Medarex/Eisai/Genmab) ;CDP571 为人源化抗-TNF-a IgG4 抗体(Celltech) ;LDP_02 为人源化抗-α 4 β 7 抗体(LeukoSite/Genentech) ；OrthoClone 0KT4A 为人源化抗-CD4IgG 抗体(Ortho Biotech) ；ANTOVA™ 为人源化抗-CD40L IgG 抗体(Biogen) ；ANTEGREN™ 为人源化抗-VLA_4IgG 抗体(Elan);且 CAT-152 为人抗-TGF-β 2 抗体(Cambridge Ab Tech)。表8中呈现了可根据本发明使用的治疗性抗体的其他实例。[0520] 表8:抗癌症治疗性抗体
[0525]5.7.2免疫调节剂和抗炎剂[0526]本发明提供了治疗自身免疫病和炎性疾病的方法，包括结合其他治疗剂施用本发明的分子。免疫调节剂的实例包括但不限于甲氨蝶呤、ENBREL, REMICADE™、来氟米特、环磷酰胺、环孢菌素A和大环内脂抗生素(例如，FK506(他克莫司))、甲基强的松龙(MP)、皮质留类、类固醇、霉酚酸酯、雷帕霉素(西罗莫司)、咪唑立宾、脱氧精胍菌素、布喹那、malononitri1aminde (例如，来氟米特)、T细胞受体调节剂和细胞因子受体调节剂。[0527]抗炎剂已在治疗炎性疾患和自身免疫疾患方面表现出成功并且现在为用于这类疾患的常用且标准的治疗。本领域技术人员熟知的任何抗炎剂可用于本发明的方法中。抗炎剂的非限制性实例包括非类固醇抗炎药物(NSAID)、类固醇抗炎药物、β-激动齐U、抗胆碱能剂和甲基黄嘌呤。NSAID的实例包括但不限于阿司匹林、布洛芬、塞来考昔(CELEBREX™)、双氯芬酸(VOLTAREN™)、依托度酸(L0DINE™)、非诺洛芬(NALF0N™)、吲哚美辛(IND0CIN™)、酮咯酸(T0RAD0L™)、噁丙嗪(DAYPR0™)、萘丁美酮(RELAFEN™)、舒林酸(CLIN0RIL™)、托美丁(T0LECTIN™)、罗非考昔(V10XX™)、萘普生(ALEVE™、NAPROSYN™)、酪洛芬(ACTR0N™)以及萘丁美酮(RELAFEN™)。这些NSAID通过抑制环氧化酶(例如，C0X-1和/或C0X-2)发挥功能。类固醇抗炎药物的实例包括但不限于糖皮质激素、地塞米松(DECADR0N™)、可的松、氢化可的松、强的松(DELTASONE™)、强的松龙、去炎松、柳氮磺吡啶和类二十烷酸例如前列腺素、凝血噁烷和白三烯。[0528]表9中展现了可结合本发明的分子用于治疗或预防炎性疾患的抗体的非限制性实例，而表10中展现了可用于疗或预防自身免疫疾患的抗体的非限制性实例。[0529]表9:用于治疗炎性疾病的治疗性抗体
[0530]
[0537]5.7.3用于治疗传染病的剂[0538]在某些实施方式中，本发明的分子可与治疗或预防有效量的本领域技术人员已知的用于治疗和/或预防传染病的一种或另外的治疗剂组合施用。本发明设想了与本领域技术人员已知的用于治疗和或预防传染病的抗生素组合地使用本发明的分子。可与本发明的分子组合使用的抗生素包括但不限于大环内酯类(例如，妥布霉素(ToW®))、头孢菌素(例如，头孢氨苄(Keilext.)、头孢拉啶(Velose®)、头孢呋辛(Ceftin®)、头孢罗齐(Cefeil®)、头孢克洛(CedOT®)，头孢克肟(Suprax®)或头孢羟氨苄(Durieel®))、克拉仙霉素(例如，克拉仙霉素(BiaxmD))、红霉素(例如，红霉素(HMYCIN®):)、青霉素(例如，青霉素V (V-Ci 11 in Kf;或Pen Vee K® ))或喹诺酮(例如，氧氟沙星XFloxin®)、环丙沙星(Cipro+®+)或氟哌酸(诺氟沙星⑩))、氨基葡糖苷类抗生素(例如，安普霉素、阿贝卡星、黄霉素、布替罗星、地贝卡星、新霉素、新霉素、十一烯酸酯、奈替米星、巴龙霉素、核糖霉素、西索霉素和大观霉素)、胺酰醇抗生素(例如，叠氮氯霉素、氯霉素、氟苯尼考、和甲砜霉素)、安莎霉素抗生素(例如利福酰胺和利福平)、碳头孢烯(例如，氯拉卡比)、碳青霉烯(例如，比阿培南和亚胺培南)、头孢菌素(例如，头孢克洛、头孢羟氨苄、头孢孟多、头孢三嗪、头孢吡酮、头孢唑兰、头孢咪唑、头孢匹胺、和头孢匹罗)、头霉素(例如头孢拉宗、头孢美唑和头孢米诺钠)、单环内酰胺(例如，氨曲南、卡卢莫南、和替吉莫南)、氧头孢烯(例如，氟氧头孢和拉氧头孢)、青霉素(例如，氮卓西林、匹伏氮卓西林、阿莫西林、巴氨西林、苄基青霉素酸、苄基青霉素钠、依匹西林、芬贝西林、氟氯西林、培那西林、氢碘酸喷沙西林、苯乙苄胺青霉素O、青霉素O、青霉素V、苄星青霉素V、海巴青霉素V、青四环素、和苯氧乙基青霉素钾)、林可酰胺(例如，克林霉素和林可霉素)、安福霉素、杆菌肽、卷曲霉素、粘菌素、持久杀霉素、恩维霉素、四环素(例如，阿匹四环素、氯四环素、氯莫环素和脱甲金霉素)、2，4-二氨基嘧啶(例如，溴莫普林)、硝基呋喃类(例如，呋喃唑酮、和呋唑氯铵)、喹诺酮及其类似物(例如，西诺沙星、克林沙星、氟甲喹、和格雷沙星)、磺胺类(例如，乙酰磺胺甲氧吡嗪、苄磺胺、诺丙磺胺、酞磺醋胺、磺胺柯定、和磺胺乙胞嘧啶)、砜(例如，地百里砜、葡胺苯砜钠、和苯丙砜)、环丝氨酸、莫匹罗星和马铃薯球蛋白。[0539]在某些实施方式中，本发明的分子可与治疗或预防有效量的一种或多种抗真菌剂组合施用。可与本发明的分子组合使用的抗真菌剂包括但不限于两性霉素B、伊曲康唑、酮康唑、氟康唑、鞘内氟胞嘧啶、咪康唑、布托康唑、克霉唑、制霉菌素、特康唑、噻康唑、环吡司、益康唑、卤丙烷、萘替芬、特比萘芬、十一烯酸酯和灰黄霉素。[0540]在某些实施方式中，本发明的分子可与治疗或预防有效量的一种或多种抗病毒剂组合施用。可与本发明的分子组合使用的有用的抗病毒剂包括但不限于蛋白酶抑制剂，核苷逆转录酶抑制剂，非核苷逆转录酶抑制剂和核苷类似物。抗病毒剂的实例包括但不限于齐多夫定、阿昔洛韦、更昔洛韦、阿糖腺苷、碘苷、三氟尿苷、和利巴韦林、以及膦甲酸钠、金刚烷胺、金刚乙胺、沙奎那韦、茚地那韦、安泼那韦、洛匹那韦、利托那韦、α干扰素；阿德福韦、克拉夫定、恩替卡韦、普来可那立。[0541]5.8疫苗治疗[0542]本发明还包括使用本发明的组合物来引发针对抗原性或免疫原性物质，包括但不限于癌症抗原和传染病抗原(下文中公开了其实例)的免疫反应。本发明的疫苗组合物包含一种或多种抗原性或免疫原性物质，针对它们的免疫反应是期望的，其中所述一种或多种抗原性或免疫原性物质涂覆有具有增强的对Fe Y RIIIA的亲和力的本发明的变体抗体。本发明的疫苗组合物在引发免疫反应，优选地针对所述抗原性或免疫原性物质的保护性免疫反应方面是特别有效的。[0543]在某些实施方式中，本发明的疫苗组合物中的抗原性或免疫原性物质包含病毒，针对所述病毒的免疫反应是期望的。这些病毒可以是重组或嵌合的，且优选是减活的。可使用本领域技术人员已知的标准方法进行重组、嵌合以及减活病毒的制备。本发明包括待根据本发明配制的活重组病毒疫苗或灭活的重组病毒疫苗。活疫苗可能是优选的因为在宿主体内的增殖产生与自然感染中存在的相似的种类和强度的延长的刺激，并因此提供大量的、持久的免疫性。这些活重组病毒疫苗制剂的产生可使用常规方法实现，所述常规方法包括在细胞培养物或在鸡胚的尿囊中繁殖病毒，接下来纯化。[0544]在特定的实施方式中，重组病毒对其被施用的受治疗者是无致病性的。就这一点而言，为疫苗目的而使用遗传工程化的病毒可能需要这些毒株中存在减活特征。向用于转染的模板中引入适当的突变(例如，缺失)可提供具有减活特征的新型病毒。例如，可以使与温度敏感性或冷适应有关的特定错义突变成为缺失突变。这些突变应比与寒冷或温度敏感性突变体有关的点突变更稳定且逆转频率应非常低。用于构建重组病毒的重组DNA技术是本领域已知的且被包括在本发明中。例如，用于修饰负链RNA病毒的技术是本领域已知的，参见，例如，被通过引用全部并入本文的美国专利第5，166，057号。[0545]可选择地，具有“自杀”特征的嵌合病毒可被构建为用于本发明的皮内疫苗制剂中。这些病毒在宿主体内将仅经历一轮或几轮复制。当用作疫苗时，该重组病毒将经历有限的复制循环并引发足够水平的免疫反应但是它不会在人宿主中走得更远并导致疾病。可选择地，可根据本发明配制灭活的(被杀死的)的病毒。灭活的疫苗制剂可使用“杀死”嵌合病毒的常规技术制备。在其感染力被破坏的意义上说，灭活的疫苗是“死亡”的。理想地，病毒的感染力被破坏而不影响其免疫原性。为了制备灭活疫苗，可将嵌合病毒培养在细胞培养物或鸡胚的尿囊中，通过带状超速离心纯化，通过甲醛或β_丙内酯灭活并收集。[0546]在某些实施方式中，完全外源的表位，包括衍生自其他病毒或非病毒病原体的抗原可被构建到用于本发明的皮内疫苗制剂的病毒中。例如，无关病毒例如HIV的抗原(gpl60、gpl20、gp41)、寄生虫抗原(例如痕疾)、细菌或真菌抗原或肿瘤抗原可被构建到减活毒株中。[0547]几乎任何异源基因 序列可被构建到用于皮内疫苗制剂的本发明的嵌合病毒中。优选地，异源基因序列是充当生物学反应修饰物的部分和肽。优选地，引发针对多种病原体，或结合中和抗体的抗原中的任何一种的保护性免疫反应的表位可被嵌合病毒的一部分表达或被表达为嵌合病毒的一部分。例如，可被构建到本发明的嵌合病毒中的异源基因序列包括但不限于，流感和副流感血凝素神经氨酸酶和融合糖蛋白例如人PIV3的HN和F基因。在又一个实施方式中，可被构建到所述嵌合病毒中的异源基因序列包括编码具有免疫调节活性的蛋白质的序列。免疫调节蛋白的实例包括但不限于细胞因子、I型干扰素、Y干扰素、集落刺激因子、白介素-1、白介素_2、白介素_4、白介素-5、白介素-6、白介素-12和这些物质的拮抗剂。[0548]又在其他实施方式中，本发明包括在其表面上表达变体抗体的致病性细胞或病毒，优选地减活病毒。[0549]在替代实施方式中，本发明的疫苗组合物包含融合多肽，其中抗原性或免疫原性物质被可操作地连接到具有增强的对Fe Y RIIIA的亲和力的本发明的变体抗体。构建用于本发明的疫苗组合物的融合多肽使用常规的重组DNA技术方法进行且在普通技术水平之内。[0550]本发明还包括通过施用本发明的组合物引发受治疗者的耐受的方法。优选地，适合引发受治疗者的耐受的组合物包含涂覆有本发明的变体抗体的抗原性或免疫原性物质，其中所述变体抗体具有更高的对Fe Y RIIB的亲和力。虽然不期望被特定的作用机制所束缚，但是这些组合物在通过激活Fe YRIIB介导的抑制型通路来引发耐受方面是有效的。[0551]5.9组合物和施用方法[0552]本发明提供了包含含有多个表位结合结构域和任选地，Fe结构域(或其部分)的本发明的分子(即，双抗体)的方法和药物组合物。本发明还提供了通过对受治疗者施用有效量的本发明的融合蛋白或偶联分子，或包含本发明的融合蛋白或偶联分子的药物组合物来治疗、预防和改善与疾病、疾患或感染有关的一种或多种症状的方法。在优选的方面，抗体、融合蛋白或偶联分子是基本上纯化的(即，基本上不含限制其作用或产生不期望的副作用的物质)。在特定实施方式中，受治疗者是动物，优选地是哺乳动物例如非灵长类(例如，牛、猪、马、猫、狗、大鼠等)和灵长类(例如，猴例如食蟹猴和人)。在优选的实施方式中，受治疗者是人。又在另一个优选的施方式中，本发明的抗体来自与受治疗者相同的物种。[0553]各种 递送方法是已知的且可用来施用包含本发明的分子的组合物，例如，包封在脂质体、微粒、微胶囊、能够表达该抗体或融合蛋白的重组细胞中，受体介导的内吞(参见，例如 Wu 等人(1987)^Receptor-Mediated In Vitro Gene Transformation By A SolubleDNA Carrier System, ” J.Biol.Chem.262:4429-4432),将核酸构建成逆转录载体或其他载体的一部分等。施用本发明的分子的方法包括但不限于肠胃外施用(例如，皮内、粘膜内、腹膜内、静脉内和皮下)、硬脑膜外和经粘膜(例如，鼻内和口腔途径)。在特定实施方式中，本发明的分子被肌肉内、静脉内或皮下施用。这些组合物可通过任何方便的途径，例如输注或弹丸注射，通过经上皮或粘膜与皮肤的衬层(例如，口腔粘膜、结肠和肠粘膜等)吸收施用，且可与其他生物活性剂一起施用。施用可以是全身的或局部的。另外，还可采用肺部施用，例如，通过使用吸入器或雾化器以及具有气溶胶化剂的制剂。参见例如，美国专利第 6，019，968,5, 985，320,5, 985，309,5, 934，272,5, 874，064,5, 855，913,5, 290，540和 4，880，078 号，以及 PCT 公布第 TO92/19244、TO97/32572、W097/44013、W098/31346 和W099/66903号，其各自通过引用被全部并入本文。[0554]本发明还提出将本发明的分子包装在气密性密封的容器例如指示抗体量的安瓿瓶或小袋中。在一个实施方式中，本发明的分子被提供为在气密性密封的容器中的干燥无菌的冻干粉末或无水浓缩物且可例如用水和盐水重配成用于对受治疗者施用的合适浓度。优选地，本发明的分子被以至少5mg,更优选地至少10mg、至少15mg、至少25mg、至少35mg、至少45mg、至少50mg或至少75mg的单位剂量提供为气密性密封的容器中的干燥无菌的冻干粉末。应将本发明的冻干分子储存在2和8°C之间的其初始容器中且所述分子应在重配后12小时内，优选地6小时内、5小时内、3小时内或I小时内施用。在替代实施方式中，本发明的分子被以液体形式提供在指示所述分子、融合蛋白或偶联分子的量和浓度的气密性密封容器中。优选地，液体形式的本发明的分子被以至少lmg/ml，更优选地至少2.5mg/ml、至少 5mg/ml、至少 8mg/ml、至少 10mg/ml、至少 15mg/kg、至少 25mg/ml、至少 50mg/ml、至少100mg/ml、至少150mg/ml、至少200mg/ml的分子提供在气密性密封容器中。[0555]在治疗、预防或改善与疾患有关的一种或多种症状方面有效的本发明的组合物的量可通过标准临床技术确定。待在制剂中采用的准确剂量还将取决于施用途径，和病症的严重性且应根据医师的判断和每个患者的情况决定。有效剂量还可从体外或动物模型测试系统获得的剂量-反应曲线中外推得到。[0556]对于本发明所包括的抗体,对患者施用的剂量通常为0.0001mg/kg至100mg/kg患者体重。优选地，对患者施用的剂量在0.0001mg/kg和20mg/kg、0.0001mg/kg和IOmg/kg、0.0001mg/kg 和 5mg/kg、0.0001 和 2mg/kg、0.0001 和 lmg/kg、0.0001mg/kg 和 0.75mg/kg、0.0OOlmg/kg和 0.5mg/kg、0.0OOlmg/kg 至 0.25mg/kg、0.0001 至 0.15mg/kg、0.0001 至0.10mg/kg、0.001 至 0.5mg/kg、0.01 至 0.25mg/kg 或 0.01 至 0.lOmg/kg 患者体重之间。通过借助修饰诸如例如脂质化来增强双抗体的吸收和组织渗透，本发明的双抗体的剂量和施用频率可被减少或改变。[0557]在一个实施方式中，当作为单独的剂治疗使用时，对患者施用的本发明的分子的剂量可从0.0lmg至IOOOmg/天。在另一个实施方式中，本发明的分子与其他治疗性组合物组合使用且对患者施用的剂量比所述分子用作单独的剂治疗时低。[0558]在特定实施方式中，可能期望对需要治疗的区域局部施用本发明的药物组合物；这可通过例如，而非限制性地，局部输注、通过注射或通过植入物实现，所述植入物是多孔、无孔材料或胶质材料，包括 膜，例如硅氧烷膜或纤维。优选地，当施用本发明的分子时，必须小心地使用不吸收所述分子的材料。[0559]在另一个实施方式中，可在介质，特别是脂质体中递送组合物(参见Langer (1990) “New Methods Of Drug Delivery,，，Science249:1527-1533) ;Treat 等人，在 Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein和 Fidler (编辑)，Liss, New York,第 353-365 页(1989)中；Lopez-Berestein, ibid,第317-327页；一般地参见同上)。[0560]又在另一个实施方式中，可在控释或缓释系统中递送所述组合物。本领域技术人员已知的任何技术可用来产生包含一种或多种本发明的分子的缓释制剂。参见，例如美国专利第4，526，938号；PCT公布W091/05548 ；PCT公布W096/20698 ；Ning等人(1996) “Intratumoral Radioimmunotheraphy Of A Human Colon Cancer XenograftUsing A Sustained-Release Gel，” Radiotherapy&0ncology39:179-189，Song 等人(1995) “Antibody Mediated Lung Targeting Of Long-Circulating Emulsions，，，PDAJournal of Pharmaceutical Science&Technology50:372-397 ;Cleek 等人(1997)“Biodegradable Polymeric Carriers For A bFGF Antibody For CardiovascularApplication，”Pr0.1nt，1.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.24:853-854 ；以及 Lam 等人(1997) “Microencapsulation Of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody ForLocal Delivery，” Pr。。.Int’ 1.Symp.Control Rel.Bioact.Mater.24:759-760,其每一个被通过引用全部并入本文。在一个实施方式中，泵可用于控释系统中(参见Langer，上文；Sefton，(1987) “Implantable Pumps，” CRC Crit.Rev.Biomed.Eng.14:201-240 ；Buchwald 等人(1980) “Long-Term，Continuous Intravenous Heparin AdministrationBy An Implantable Infusion Pump In Ambulatory Patients With Recurrent VenousThrombosis，，，Surgery88:507-516 ；和 Saudek 等人(1989) “A Preliminary Trial OfThe Programmable Implantable Medication System For Insulin Delivery, N.Engl.J.Med.321:574-579)。在另一个实施方式中，聚合物材料可用来实现抗体的控释(参见，例如 Medical Applications of Controlled Release, Langer 和 Wise (编辑)，CRC Pres.，Boca Raton, Florida(1974):Controlled Drug Bioavailability，DrugProduct Design and Performance, Smolen 和 Ball(编辑)，Wiley, New York(1984)；Levy 等人(1985) “Inhibition Of Calcification Of Bioprosthetic Heart ValvesBy Local Controlled-Release Diphosphonate，，，Science228:190-192 ;During 等人(1989) “Controlled Release Of Dopamine From A Polymeric Brain Implant:In VivoCharacterization，，，Ann.Neurol.25:351-356 ;Howard 等人(1989) “IntracerebralDrug Delivery In Rats With Lesion-1nduced Memory Deficits,J.Neurosurg.7 (I):105-112);美国专利第5，679，377号；美国专利第5，916，597号；美国专利第5，912，015号；美国专利第5，989，463号；美国专利第5，128，326号；PCT公布第W099/15154号；以及PCT公布第W099/20253号)。用于缓释制剂中的聚合物的实例包括但不限于聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸)、聚(乙烯-共-醋酸乙烯酯)、聚(甲基丙烯酸)、聚乙交酯(PLG)、聚酸酐、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚丙烯酰胺、聚(乙二醇)、聚丙交酯(PLA)、聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)和聚原酸酯。又在另一个实施方式中，控释系统可邻近治疗靶(例如，肺)放置，从而只需要全身剂量的一部分(参见，例如Goodson，在Medical Applications of Controlled Release,上文，第 2卷，第 115-138页(1984)中)。在另一个实施方式中，根据Durm等人(参见U.S.5，945，155)使用作为控释植入物有用的聚合物组合物。这种特别的方法基于生物活性材料从聚合物系统中的原位控释的治疗作用。植入通常可发生在需要治疗性治疗的患者身体的任何地方。在另一个实施方式中，使用了非聚合物持续递送系统，其中受治疗者身体内的非聚合物植入物用作药物递送系统。经植入到体内后，植入物的有机溶剂将从组合物中消散、分散或浸出到周围组织液中，且非聚合物材料将逐渐聚集或沉淀形 成固体、微孔基质(参见U.S.5，888，533)。[0561] Langer 的综述(1990，“New Methods Of Drug Delivery，，，Science249:1527-1533)中讨论了控释系统。本领域技术人员已知的任何技术可用来产生包含一种或多种本发明的治疗剂的缓释制剂。参见，例如美国专利第4，526，938号；国际公布第 W091/05548 和 W096/20698 号；Ning 等人(1996) “ IntratumoralRadioimmunotheraphy Of A Human Colon Cancer Xenograft Using A Sustained-ReleaseGel,，，Radiotherapy&0ncology39:179-189, Song 等人(1995) “Antibody MediatedLung Targeting Of Long-Circulating Emulsions,，，PDA Journal of PharmaceuticalScience&Technology50:372-397 ；Cleek 等人(1997) “Biodegradable PolymericCarriers For A bFGF Antibody For Cardiovascular Application,，，Pr0.1ntJ 1.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.24:853-854 ；以及 Lam 等人(1997) “Microencapsulation OfRecombinant Humanized Monoclonal Antibody For Local Delivery,’Troc.1ntJ1.Symp.Control Rel.Bioact.Mater.24 :759-760,其每一个被通过引用全部并入本文。[0562]在其中本发明的组合物是编码本发明的双抗体的核酸的特定实施方式中，所述核酸可以体内施用来促进它编码的双抗体的表达，通过将所述核酸构建为合适的核酸表达载体的一部分并施用它使得其成为细胞内的，例如通过使用逆转录病毒载体(参见美国专利第4，980，286号)，或通过直接注射，或通过使用微粒轰击(例如，基因枪；Biolistic,Dupont)，或涂覆脂质或细胞表面受体或转染剂，或通过将其连接到已知进入核的同源盒样月太来施用(参见，例如 Joliot 等人(1991) “Antennapedia Homeobox Peptide RegulatesNeural Morphogenesis, ”Proc.Natl.Acad.Sc1.USA88:1864-1868)等。可选择地，核酸可被引入到细胞内并被整合到宿主细胞DNA内以通过同源重组表达。[0563]用治疗或预防有效量的本发明的分子治疗受治疗者可包括单次治疗或优选地，可包括系列治疗。在优选的实例中，用约0.1至30mg/kg体重范围内的本发明的分子每周一次地治疗受治疗者，持续约I至10周之间，优选地2至8周之间，更优选地约3至7周之间，且甚至更优选地持续约4、5或6周。在其他实施方式中，一天一次、一天两次或一天三次地施用本发明的药物组合物。在其他实施方式中，一周一次、一周两次、每两周一次、一月一次、每六周一次、每两月一次、一年两次或一年一次地施用该药物组合物。还将理解用于治疗的分子的有效剂量可随特定的治疗进程增加或减少。[0564]5.9.1药物组合物[0565]本发明的组合物包括在制造药物组合物方面有用的原料药组合物(bulk drugcomposition)(例如,不纯的或非无菌组合物)和可用于制备单位剂型的药物组合物(即，适合对受治疗者或患者施用的组合物)。这些组合物包含预防或治疗有效量的本文公开的预防和/或治疗剂或这些剂的组合以及药学上可接受的载体。优选地，本发明的组合物包含预防或治疗有效量的一种或多种本发明的分子以及药学上可接受的载体。[0566]本发明还包括包含本发明的双抗体分子和对特定癌症抗原特异性的治疗性抗体(即，肿瘤特异性单克隆抗体)以及药学上可接受的载体的药物组合物。[0567]在特定实施方式中，术语“药学上可接受的”意思是被美国联邦或州政府的监管局所批准的或在美国药典或用于动物且更特别是人的其他公认的药典中列出的。术语“载体”是指与治疗剂一起施用的稀释剂、佐剂(例如，弗氏佐剂(完全的和不完全的))、赋形剂或媒介物。这些药物载体可以是无菌液体例如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的油，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油及类似的油。当静脉内施用药物组合物时，水是优选的载体。特别是对于可注射溶液，盐溶液和含水葡萄糖以及甘油溶液也可用作液体载体。合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、水稻、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、甘油单硬脂酸酯、滑石、氯化钠、脱脂乳、甘油、丙二醇、水、乙醇及类似物。如期望的话，组合物还可包含少量的润湿剂或乳化剂或PH缓冲剂。这些组合物可采取溶液、悬浮液、乳液、片剂、丸剂、胶囊、粉末、缓释制剂及类似物的形式。
[0568]通常，本发明的组合物的成分被单独或混合在一起地提供在单位剂型中，例如，在指示活性剂的量的气密性密封容器例如安瓿瓶或小袋中作为冻干粉末或无水浓缩物。如组合物待通过输注施用的话，则其可用包含药物级无菌水或盐水的输注瓶分配。如通过注射施用组合物的话，则可提供一安瓿的用于注射用无菌水或盐水使得这些成分可在施用前被混合。
[0569]本发明的组合物可被配制为中性或盐形式。药学上可接受的盐包括但不限于与阴离子例如衍生自盐酸、磷酸、醋酸、草酸、酒石酸等的阴离子形成的盐，以及与阳离子例如衍生自氢氧化钠、钾、铵、钙、铁、异丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、组胺、普鲁卡因等的阳离子形成的盐。
[0570]5.9.2基因治疗
[0571]在特定实施方式中，施用包含编码本发明的分子的序列的核酸以通过基因治疗的方式治疗、预防或改善与疾病、疾患或感染有关的一种或多种症状。基因治疗是指通过对受治疗者施用表达的或可表达的核酸而进行的治疗。在本发明的该实施方式中，核酸产生其所编码的介导治疗或预防作用的抗体或融合蛋白。
[0572]可根据本发明使用本领域中可获得的用于基因治疗的任何方法。以下描述了示例性的方法。
[0573]对于基因治疗方法的概括性综述，参见Goldspiel等人(1993) “Human GeneTherapy, ” Clinical Pharmacy 12:488-505 ;Wu 等人(1991) “Delivery Systems ForGene Therapy, ^BiotherapyS:87-95 ；Tolstoshev(1993) “Gene Therapy, Concepts,Current Trials And Future Directions,，，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32:573-596 ;Mulligan (1993) “The Basic Science Of Gene Therapy,，，Science260:926-932 ;以及Morgan 等人(1993) “Human Gene Therapy,，，Ann.Rev.Biochem.62:191_217。可使用的重组DNA技术领域通常已知的方法被描述在Ausubel等人(编辑),Current Protocolsin Molecular Biology, Tohn ffiley&Sons, NY(1993):和 Kriegler, Gene Transfer andExpression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY(1990)中。
[0574]在优选的方面，本发明的组合物包含编码本发明的双抗体的核酸，所述核酸为在合适的宿主中表达所述抗体的表达载体的一部分。特别地，这些核酸具有可操作地连接到抗体编码区域的启动子，优选地异源启动子，所述启动子是诱导型或组成型的，且任选地，是组织特异性的。在另一个特定的实施方式中，使用了核酸分子，在所述核酸分子中抗体编码序列和任何其他期望序列的旁侧是促进在基因组的期望位点处的同源重组的区域，从而提供抗体编码核酸的染色体内表达(Koller等人(1989) “InactivatingThe Beta2_Microglobulin Locus In Mouse Embryonic Stem Cells By hom*ologousRecombination,，，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA86:8932-8935 ;和 Zijlstra 等人(1989)“Germ_Line Transmission Of A Disrupted Beta2_Microglobulin Gene ProducedBy hom*ologous Recombination In Embryonic Stem Cells,，，Nature342:435-438)。
[0575]在另一个优选的方面， 本发明的组合物包含编码融合蛋白的核酸，所述核酸为在合适的宿主中表达所述融合蛋白的表达载体的一部分。特别地，这些核酸具有可操作地连接到融合蛋白的编码区域的启动子，优选地异源启动子，所述启动子是诱导型或组成型的，且任选地，是组织特异性的。在另一个特定的实施方式中，使用了核酸分子，在所述核酸分子中融合蛋白的编码序列和任何其他期望序列的旁侧是促进在基因组的期望位点处的同源重组的区域，从而提供融合蛋白的染色体内表达。
[0576]向受治疗者递送核酸可以是直接的，在这种情况下，受治疗者被直接暴露于核酸或携带核酸的载体，或是间接的，在这种情况下，先用核酸体外转化细胞，然后移植到受治疗者体内。这两种方法分别作为体内或活体外基因治疗是已知的。
[0577]在特定实施方式中，核酸序列被直接体内施用到其被表达以产生所编码产物的地方。这可通过本领域已知的许多方法中的任何一种实现,例如，通过将其构建为合适的核酸表达载体的一部分并施用它使得其成为细胞内的，例如，通过使用缺陷性或减活的逆转录病毒或其他病毒载体进行感染(参见美国专利第4，980，286号)，或通过直接注射裸露的DNA，或通过使用微粒轰击(例如，基因枪；Biolistic，Dupont)或涂覆脂质或细胞表面受体或转染剂，包封在脂质体，微粒或微胶囊中，或通过将其连接到已知进入核的肽来施用，通过将其连接到经受受体介导的内吞作用的抗原来施用(参见，例如 Wu 等人(1987) “Receptor-Mediated In Vitro Gene Transformation By ASoluble DNA Carrier System, ” J.Biol.Chem.262:4429-4432)(其可用来革巴向特异性表达受体的细胞类型)等。在另一个实施方式中，可形成核酸-抗原复合体，其中抗原包含融合病毒肽以破坏内体，允许核酸避免被溶酶体降解。又在另一个实施方式中，通过靶向特异性受体，所述核酸可 被体内靶向以便细胞特异性摄取和表达(参见，例如PCT 公布 W092/06180 ；W092/22635 ；W092/20316 ；W093/14188 ；W093/20221)。可选择地，核酸可被引入到细胞内并被整合到宿主细胞DNA内以通过同源重组表达(Koller等人(1989)“Inactivating The Beta2_Microglobulin Locus In Mouse Embryonic Stem CellsBy hom*ologous Recombination, ”Proc.Natl.Acad.Sc1.USA86:8932-8935 ；Zi jlstra 等人(1989)“Germ_Line Transmission Of A Disrupted Beta2_Microglobulin Gene ProducedBy hom*ologous Recombination In Embryonic Stem Cells,，，Nature342:435-438)。
[0578]在特定实施方式中，使用包含编码本发明的分子(即，双抗体或融合蛋白)的核酸序列的病毒载体。例如，可使用逆转录病毒载体(参见Miller等人(1993) “UseOf Retroviral Vectors For Gene Transfer And Expression,，，Meth.Enzymol.217:581-599)。这些逆转录病毒载体包含病毒基因组的正确包装和整合到宿主细胞DNA所必需的组分。待用于基因治疗的编码所述抗体或融合蛋白的核酸序列被克隆到一种或多种载体中，这促进对受治疗者递送该核苷酸序列。关于逆转录病毒载体的更多细节可在Boesen 等人(1993) “Circumvention Of Chemotherapy-1nduced Myelosuppression ByTransfer Of The MdrlGene, ”Biotherapy6:291-302 中发现,其描述了使用逆转录病毒载体来将mdrl基因递送至造血干细胞以制备对化疗抗性更大的干细胞。阐述了在基因治疗中使用逆转录病毒载体的其他参考文献是:Clowes等人(1994) “Long-Term BiologicalResponse Of Injured Rat Carotid Artery Seeded With Smooth Muscle CellsExpressing Retrovirally Introduced Human Genes,，，J.Clin.1nvest.93:644-651 ;Keim 等人(1994) “Retrovirus-Mediated Gene Transduction Into Canine PeripheralBlood Repopulating Cells,，，Blood83:1467-1473 ;Salmons 等人(1993) “Targeting OfRetroviral Vectors For Gene Therapy, Tiuman Gene Therapy4:129-141 ;和Grossman等人(1993) “Retroviruses:Delivery Vehicle To The Liver,，，Curr.0pin.Genetics andDevel.3:110_114。
[0579]腺病毒是可用于基因治疗的其他病毒载体。腺病毒是用于向呼吸上皮递送基因的尤其有吸引力的工具。腺病毒天然地感染呼吸上皮，其在呼吸上皮中导致轻微的疾病。用于基于腺病毒的递送系统的其他靶是肝、中枢神经系统、内皮细胞和肌肉。腺病毒具有能够感染非分裂细胞的优点。Kozarsky等人(1993, “Gene Therapy:AdenovirusVectors,’’Current Opinion in Genetics and Developments:499-503)提供了基于腺病毒的基因治疗的综述。Bout等人(1994,“Lung Gene Therapy:1n Vivo Adenovirus-MediatedGene Transrer To Rhesus Monkey Airway Epithelium,，，Human Gene Therapy,5:3-10)阐述了使用腺病毒载体来将基因转移到猕猴的呼吸上皮中。在基因治疗中使用腺病毒的其他实例可在 Rosenfeld 等人(1991) “Adenovirus-Mediated Transfer Of ARecombinant Alphal-Antitrypsin Gene To The Lung Epithelium In Vivo,，，Science252:431-434 ;Rosenfeld 等人(1992) “In Vivo Transfer Of The Human Cystic FibrosisTransmembrane Conductance Regulator Gene To The Airway Epithelium,，，Cell68:143-155 ；Mastrangeli 等人(1993) “Diversity Of Airway Epithelial CellTargetsFor In Vivo Recombinant Adenovirus-Mediated Gene Transfer, ^J.Clin.1nvest.91:225-234 ；PCT 公布 W094/12649 和 Wang 等人(1995) “A Packaging Cell Line ForPropagation Of Recombinant Adenovirus Vectors Containing Two Lethal Gene-RegionDeletions, ” Gene Therapy2:775-783中发现。在优选的实施方式中，使用腺病毒载体。
[0580]已提出腺相关病毒(AAV)用于基因治疗(参见，例如Walsh等人(1993) “GeneTherapy For Human Hemoglobinopathies,’Troc.Soc.Exp.Biol.Med.204:289-300和美国专利第5，436，146号)。
[0581]针对基因治 疗的另一种方法包括通过这些方法如电穿孔、脂质体转染、磷酸钙介导的转染或病毒感染来将基因转移到组织培养中的细胞中。通常，转移方法包括将选择性标记转移到细胞。然后可对细胞进行选择以分离已摄取并表达所转移的基因的那些细胞。然后将那些细胞递送至受治疗者。
[0582]在该实施方式中，在体内施用所得的重组细胞之前将核酸引入到细胞中。该引入可通过本领域已知的任何方法进行，包括但不限于转染、电穿孔、微注射、用包含核酸序列的病毒或噬菌体载体感染、细胞融合、染色体介导的基因转移、微细胞介导的基因转移、原生质球融合等。用于将外源基因引入到细胞的许多技术是本领域已知的(参见，例如 Loeffler 等人(1993) “Gene Transfer Into Primary And Established MammalianCell Lines With Lipopolyamine-Coated DNA,，，Meth.Enzymol.217:599-618, Cotten 等人(1993) “Receptor-Mediated Transport Of DNA Into Eukaryotic Cells,，，Meth.Enzymol.217:618-644且可根据本发明使用，条件是接受体细胞的必要的发育和生理功能不受破坏。该技术应提供核酸被稳定转移至细胞，使得该核酸可被该细胞表达且优选地可被其细胞后代遗传和表达。
[0583]所得的重组细胞可通过本领域已知的多种方法被递送至受治疗者。优选地静脉内施用重组的血液细胞(例如，造血干细胞或祖细胞)。被预期使用的细胞的量取决于所期望的作用、患者的状态等，且可由本领域技术人员确定。
[0584]为了基因治疗的目的可引入核酸的细胞包括任何期望的、可获得的细胞类型且包括但不限于上皮细胞、内皮细胞、角质形成细胞、成纤维细胞、肌细胞、肝细胞；血细胞如T淋巴细胞、B淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、中性白细胞、嗜酸性粒细胞、巨核细胞，粒细胞；各种干细胞或祖细胞，尤其是例如，从骨髓，脐带血，外周血，胎肝等获得的造血干细胞或祖细胞。
[0585]在优选的施方式中，用于基因治疗的细胞对于受治疗者是自体的。
[0586]在其中重组细胞被用于基因治疗的实施方式中，编码抗体或融合蛋白的核酸序列被引入细胞使得其可由细胞或其后代表达，且然后这些重组细胞可被体内施用以获得治疗作用。在特定实施方式中，使用了干细胞或祖细胞。可被分离并体外维持的任何干细胞和/或祖细胞可被潜在地用于根据本发明的该实施方式(参见，例如PCT公布W094/08598 ；Stemple 等人(1992) “Isolation Of A Stem Cell For Neurons And Glia From TheMammalian Neural Crest,，，Cell71:973-985 ;Rheinwald(1980) “Serial CultivationOf Normal Human Epidermal Keratinocytes,，，Meth.Cell Bi0.21A:229-254 ；以及Pittelkow 等人(1986) “New Techniques For The In Vitro Culture Of Human SkinKeratinocytes And Perspectives On Their Use For Grafting Of Patients WithExtensive Burns,^Mayo Clinic Proc.61:771-777)。
[0587]在特定实施方式中，为了基因治疗的目的待引入的核酸包含可操作地连接至编码区域的诱导型启动子，使得通过控制合适的转录诱导剂的存在或不存在，核酸表达可被控制。
[0588]5.9.3 药盒
[0589]本发明提供了包含装有本发明的分子的一种或多种容器的药物包装或药盒。另夕卜，对治疗疾病有用的一种或多种其他预防或治疗剂也可被包括在所述药物包装或药盒中。本发明还提供了包含装有本发明的药物组合物的一种或多种成分的一种或多种容器的药物包装或药盒。任选地这些容器带有可以是由监管药物或生物学产品的生产、使用或销售的政府部门规定形式的通知，该通知反映生产、使用或销售的监管部门对人类施用的许可。
[0590]本发明提供了可用于上述方法中的药盒。在一个实施方式中，药盒包含一种或多种本发明的分子。在另一个实施方式中，药盒还包含对治疗癌`症有用的位于一种或多种容器中的一种或多种其他预防或治疗剂。在另一个实施方式中，药盒还包含结合与癌症有关的一种或多种癌症抗原的一种或多种细胞毒性抗体。在某些实施方式中，所述其他预防或治疗剂是化疗剂。在其他实施方式中，所述预防或治疗剂是生物治疗剂或激素治疗剂。
[0591]5.10治疗效用的表征和证实
[0592]优选地在用于人类之前，在细胞培养系统和在动物模型生物体，例如啮齿动物模型系统中体外测试本发明的药物组合物、预防或治疗剂的多个方面以获得期望的治疗活性。例如，可用来确定特定药物组合物的施用是否是期望的测定包括细胞培养测定，其中患者的组织样品被培养在培养物中，并被暴露于本发明的药物组合物或以其他方式与之接触，并观察该组合物对所述组织样品的作用。该组织样品可通过来自患者的组织活检获得。该测试允许鉴定在治疗上对于各个单独的患者最有效的预防或治疗性分子。在多个特定实施方式中，体外测定可用参与自身免疫或炎性疾患的细胞类型的代表性细胞(例如，T细胞)进行以确定本发明的药物组合物是否对这些细胞类型具有期望的作用。
[0593]可在用于人类之前在合适的动物模型系统中测试预防和/或治疗剂的组合。这些动物模型系统包括但不限于大鼠、小鼠、鸡、牛、猴、猪、狗、兔等。可使用本领域熟知的任何动物系统。在本发明的特定实施方式中，在小鼠模型系统中测试预防和/或治疗剂的组合。这些模型系统被广泛使用且是技术人员所熟知的。预防和/或治疗剂可被重复施用。程序的各个方面可变化。所述方面包括施用预防和/或治疗剂的时间方案，以及这些剂是被单独施用还是作为混合物施用。
[0594]用于本发明的方法中的优选动物模型是，例如在小鼠效应细胞上表达人Fe YR的转基因小鼠，例如，U.S.5，877，396 (其被通过引用全部并入本文)中描述的任何小鼠模型可用于本发明中。用于本发明的方法中的转基因小鼠包括但不限于携带人Fe YRIIIA的小鼠；携带人Fe Y RIIA的小鼠；携带人Fe Y RIIB和人Fe Y RIIIA的小鼠；携带人Fe Y RIIB和人Fe YRIIA的小鼠。优选地，将测试在上述功能测定中表现出最高活性水平的突变在用于人类之前用于动物模型研究中。使用上文描述的方法，例如使用本文公开和例示的哺乳动物表达系统及纯化方法，可制备用于动物模型中的足够量的抗体。
[0595]可基于本发明的双抗体分子的表位结合结构域的亲和力和特异性以及所述双抗体引发免疫反应的能力使用小鼠异种移植模型来检验针对肿瘤特异性靶所产生的小鼠抗体的功效(Wu 等人(2001) “Mouse Models For Multistep Tumorigenesis,，，TrendsCell Biol.11:S2_9)。在小鼠效应细胞上表达人Fe γ R的转基因小鼠是独特的且是测试人Fc-Fc Y R相互作用的特制的动物模型。可使用在Dr.Jeffrey Ravetch的实验室中产生的数对 Fe Y RIIIA、Fc Y RIIIB 和 Fe Y RIIA 转基因小鼠品系(经过 Rockefeller U.和 SloanKettering Cancer center的许可)，例如下表11中所列出的。
[0596]表11:小鼠品系
[0597]
[0598]本发明的组合治疗的抗炎活性可通过使用本领域已知和在Crofford L.J.和Wilder R.L., “Arthritis and Autoimmunity in Animals，，，在 Arthritis and AlliedConditions:A Textbook of Rheumatology 中，McCarty 等人(编辑)，第 30 章(Lee 和Febiger,1993)中描述的炎性关节炎的多种实验动物模型来确定。炎性关节炎和自身免疫风湿性疾病的实验的和天然的动物模型也可被用来评价本发明的组合治疗的抗炎活性。以下是作为实例而非限制性地提供的一些测定。
[0599]本领域已知且被广泛使用的用于关节炎或炎性疾病的主要动物模型包括:佐剂引发的关节炎大鼠模型、胶原引发的关节炎大鼠和小鼠模型以及抗原引发的关节炎大鼠、兔和仓鼠模型都被描述在 Crofford L.J.和 Wilder R.L.“Arthritis and Autoimmunityin Animals，，在 Arthritis and Allied Conditions:A Textbook of Rheumatology 中,McCarty等人(编辑)，第30章(Lee和Febiger, 1993),其被通过引用全部被并入本文。
[0600]本发明的组合治疗的抗炎活性可使用角叉菜聚糖引发的关节炎大鼠模型评价。在对慢性关节炎或炎症的研究中，角叉菜聚糖引发的关节炎还可在兔、狗和猪中使用。定量组织形态学评价用来确定治疗功效。使用该角叉菜聚糖引发的关节炎模型的方法被描述在Hansra P.等人(2000) “Carrageenan-1nduced Arthritis In The Rat,，，Inflammation,24(2):141-155中。如本领域已知和描述的，另外通常使用的是酵母聚糖引发的炎症动物模型。
[0601]使用对在Winter C.A.等人(1962) ^Carrageenan-1nduced Edema In Hind PawOf The Rat As An Assay For Ant1-1nflammatory Drugs，，Proc.Soc.Exp.Biol Med.1ll,544-547中描述的方法的修改，本发明的组合治疗的抗炎活性还可通过在大鼠中测量对角叉菜聚糖引发的爪水肿的抑制来评价。该测定已被用作对大多数NSAID的抗炎活性的初级体内筛选，且被认为是对人的功效的预测。受试预防或治疗剂的抗炎活性被表示为测试组相对于媒介物用药的对照组对后爪重量的增加的抑制百分比。
[0602]另外，用于炎性肠病的动物模型也可用来评价本发明的组合治疗的功效(Kim等人(1992) “Experimental Colitis In Animal Models,，，Scand.J.Gastroentrol.27:529-537 ；Strober (1985) “Animal Models Of Inflammatory Bowel Disease-AnOverview, ”Dig.Dis.Sc1.30(12增刊):3S_10S)。溃疡性气管炎和克罗恩病是可在动物中诱导的人类炎性肠病。可对 动物口服施用硫酸化的多糖包括但不限于支链淀粉、角叉菜、硫酸支链淀粉以及硫酸葡聚糖或化学刺激物包括但不限于三硝基苯磺酸(TNBS)和乙酸以诱导炎性肠病。
[0603]用于自身免疫疾患的动物模型也可用来评价本发明的组合治疗的功效。已研发出用于自身免疫疾患例如I型糖尿病、甲状腺自身免疫病、系统性红斑狼疮和肾小球性肾炎的动物模型(Flanders 等人(1999) “Prevention Of TypelDiabetes From LaboratoryTo Public Health,，，Autoimmunity29:235-246 ;Rasmussen 等人(1999) “ModelsTo Study The Pathogenesis Of Thyroid Autoimmunity,，，Biochimie81:511-515 ;Foster(1999)^Relevance Of Systemic Lupus Erythematosus Nephritis Animal ModelsTo Human Disease,，’Semin.Nephrol.19:12-24)。
[0604]此外，本领域技术人员已知的任何测定可用来评价本文公开的组合治疗对自身免疫病和/或炎性疾病的预防和/或治疗效用。
[0605]本发明的预防和/或治疗方法的毒性和功效可通过标准药物程序在细胞培养物或实验动物中确定，例如以便确定LD5tl (对50 %群体的致死剂量)和ED5tl (在50 %群体中的治疗有效的剂量)。毒性和治疗作用之间的剂量比是治疗指数且其可表示为LD5tZED5tl比。显示出大的治疗指数的预防和/或治疗剂是优选的。虽然可使用显示出毒性副作用的预防和/或治疗剂，但是应仔细地设计将这些剂靶向到被影响的组织位点的递送系统以将对未被感染的细胞的可能性损害降至最少，并从而减少副作用。
[0606]从细胞培养测定和动物研究获得的数据可用于配制用于人类的预防和/或治疗剂的剂量范围。这些剂的剂量优选地落在包括ED5tl的循环浓度的范围内，具有很少或没有毒性。所述剂量可根据所采用的剂型和所使用的施用途径在该范围内变化。对于用于本发明的方法中的任何剂，可先从细胞培养测定估计治疗有效剂量。如在细胞培养中确定的，可将剂量配制在动物模型中以达到包括IC5(I(即，实现对症状的半数最大抑制的受试化合物的浓度)的循环血浆浓度范围。该信息可用来更准确地确定人中有用的剂量。血浆中的水平可例如通过高效液相层析测量。
[0607]根据本发明使用的治疗的抗癌活性还可通过使用本领域已知的和在Relevance of Tumor Models for Anticancer Drug Development (1999,编辑 Fiebig 和Burger) ；Contributions to Oncology(1999, Karger) ；The Nude Mouse in OncologyResearch(1991,编辑.Boven 和 Winograd)；以及 Anticancer Drug DevelopmentGuide (1997版.Teicher)中描述的用于研究癌症的各种实验动物模型例如SCID小鼠模型或转基因小鼠或具有人异种移植物的裸鼠、动物模型例如仓鼠、兔等确定，本文通过引用将这些文献全部并入。
[0608]用于确定本发明的分子的治疗功效的优选动物模型是小鼠异种移植模型。可用作异种移植肿瘤来源的肿瘤细胞系包括但不限于可从患乳腺癌的患者获得的SKBR3和MCF7细胞。这些细胞具有erbB2和催乳素受体。在本领域中，SKBR3细胞已被常规地用于ADCC和异种移植肿瘤模型。可选择地，从人卵巢腺癌获得的0VCAR3细胞可用作用于异种移植肿瘤的来源。
[0609]优选地在用于人类之前体外测试并然后体内测试本发明的方案和组合物的期望的治疗或预防活性。治疗剂和方法可使用肿瘤细胞或恶性细胞系筛选。本领域的许多标准测定可用来评价该存活和/或生长；例如，细胞增殖可通过测量3H-胸腺嘧啶掺入，通过直接的细胞计数，通过检测已知基因例如前原癌基因(例如，foS、myc)或细胞周期标志的转录活性的变化测定；细胞活力可通过台盼蓝染色评价，分化可基于形态学变化、生长减弱和/或软琼脂中的集落形成或三维基膜或细胞外基质制备物中管状网络的形成等肉眼测定。
[0610]在人类中检测之前，可在合适的动物模型系统中检测用于治疗的化合物，包括但不限于大鼠、小鼠、鸡、牛、猴、兔、仓鼠等，例如上述动物模型。然后可将这些化合物用于合适的临床试验中。
[0611]另外，本领域技术人员已知的任何测定可用来评价本文公开的组合治疗对治疗或预防癌症、炎性疾患或 自身免疫病的预防和/或治疗效用。6实施例
[0612]6.1共价双特异性双抗体的设计和表征
[0613]构建单特异性共价双抗体和双特异性共价双抗体以评价各自的重组产生、纯化和结合特征。通过SDS-PAGE和SEC分析发现通过本文描述的重组表达系统产生的亲和纯化的双抗体分子由单一的二聚体物质组成。ELISA和SPR分子还表明该共价双特异性双抗体对两种靶抗原都显示出亲和力且可同时结合两种抗原。
[0614]材料和方法
[0615]多肽分子的构建和设计:设计核酸表达载体以产生图2中图示地呈现的四种多肽构建体。构建体⑴(SEQ ID NO:9)包含识别Fe y RIIB的人源化2B6抗体的VL结构域和识别Fe Y RIIIA的人源化3G8抗体的VH结构域。构建体⑵(SEQ ID NO:11)包含Hu3G8的VL结构域和Hu2B6的VH结构域。构建体(3) (SEQ ID NO:12)包含Hu3G8的VL结构域和Hu3G8的VH结构域。构建体⑷(SEQ ID NO:13)包含Hu2B6的VL结构域和Hu2B6的VH结构域。
[0616]PCR和表达载体的构建:VL或VH结构域的编码序列使用所设计的正向和反向引物从模板DNA扩增使得初始PCR产物将包含重叠序列，允许重叠PCR产生期望的多肽构建体的编码序列。
[0617]樽板DNA的初始PCR扩增:将约35ng的模板DNA，例如，目的抗体的轻链和重链；Iul 的 IOuM 正向和反向引物；2.5ul 的 IOx pfuUltra 缓冲液(Stratagene, Inc.) ；Iul 的IOmM dNTP ；lul 的 2.5 单位 /ul 的 pfuUltra DNA 聚合酶(Stratagene, Inc.)和蒸懼水至25ul的总体积轻轻地混合在miciOfuge管中并在微型离心机中短暂地旋转以将反应混合物收集在管的底部。使用GeneAmp PCR System9700 (PE Applied Biosystem)和以下设置进行PCR反应:94°C，2分钟；以下的25个循环:94°C，每次15秒；58°C，30秒；和72°C，I分钟。
[0618]使用分别为SEQ ID N0:55和SEQ ID NO:56的正向和反向引物从Hu2B6的轻链扩增Hu2B6的VL。使用分别为SEQ ID NO:57和SEQ ID NO:58的正向和反向引物从Hu2B6的重链扩增Hu2B6的VH。使用分别为SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:59的正向和反向引物从Hu3G8的轻链扩增Hu3G8的VL。使用分别为SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:61的正向和反向引物从Hu3G8的重链扩增Hu3G8的VH。
[0619]在120伏下在I %琼脂糖凝胶上对PCR产物进行电泳，持续30分钟。从凝胶上切下PCR产物并使用MinElute GEl提取试剂盒(Qiagen, Inc.)纯化。
[0620]重叠PCR:如下所述地合并初始PCR产物并使用对模板DNA的初始扩增所描述的相同的PCR条件扩增。另外如上文描述地纯化重叠PCR的产物。
[0621]编码构建体ISEQ ID NO:9(图2中图示地示出的)的核酸序列通过合并VL Hu2B6和VH Hu3G8的扩增PCR产物以及分别为SEQ ID NO:55和SEQ ID N0:61的正向和反向引物扩增。编码构建体2SEQ ID NO:11(图2中图示地示出的)的核酸序列通过合并VLHu3G8和VH Hu2B6的扩增PCR产物以及分别为SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:58的正向和反向引物扩增。编码构建体3SEQ ID NO:12(图2中图示地示出的)的核酸序列通过合并VL Hu3G8和VH Hu3G8的扩增PCR产物以及分别为SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:61的正向和反向引物扩增。编码构建体4SEQ ID NO:13(图2中图示地示出的)的核酸序列通过合并VL Hu2B6和VH Hu2B6的扩增PCR产物以及分别为SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:58的正向和反向引物扩增。
[0622]VL结构域的正向引物(B卩，SEQ ID NO:55)和VH结构域的反向引物(S卩，SEQIDN0:58和SEQ ID NO:61)包含允许将最终产物克隆到表达载体的独特限制性位点。用限制性核酸内切酶NheI和EcoR I消化纯化的重叠PCR产物，并将其克隆到pCIneo哺乳动物表达载体(Promega, Inc.)中。如表12中标示的,命名了编码构建体的质粒:
[0623]表12质粒构建体
[0624]
[0625]
[0626]多肽/双抗体表达:使用Lipofectamine2000根据厂家指导(Invitrogen)将编码构建体I的PMGX0669与编码构建体2的pMGX0667 —起共转染到HEK-293细胞中。这两种质粒的共转染被设计成导致对Fe Y RIIB和Fe YRIIIA都具免疫特异性的共价双特异性双抗体(CBD) (h2B6-h3G8双抗体)的表达。将分别编码构建体3和4的pMGX0666和pMGX0668分别转染到HEK-293细胞中以分别表达分别对Fe y RIIIA(h3G8双抗体)和Fe Y RIIB (h2B6双抗体)具免疫特异性的共价单特异性双抗体(CMD)。培养三天后，从条件培养基中纯化所分泌的产物。
[0627]纯化:使用偶联到CNBr活化的Sepharose4B的相关抗原从条件培养基中捕获双抗体。在上样前在20mM Tris/HCl，pH8.0中平衡亲和S印harose树脂。上样后，在洗脱前用平衡缓冲液洗涤树脂。使用50mM甘氨酸pH3.0从所洗涤的树脂中洗脱双抗体。立即用IM Tris/HCl pH8.0中和所洗脱的双抗体并使用离心型浓缩器浓缩。使用在PBS中平衡的Superdex200柱通过尺寸排阻层析进一步纯化所浓缩的双抗体。
[0628]述^使用尺寸排阻层析分析从柱洗脱的双抗体的大致尺寸和异质性。在用PBS平衡的 GE healthcare Superdex200HR10/30 柱上进行 SEC 分析。与全长 IgG (〜150kDa)的洗脱曲线比较，Fab片段(〜50kDa)和单链Fv (〜30kDa)用作对照。
[0629]ELISA:通过如在5.4.2中描述的ELISA测定表征所洗脱和纯化的双抗体的结合。在碳酸盐缓冲液中，在4°C下将50 μ I/孔的2 μ g/ml s⑶32B_Ig溶液过夜包被在96-孔Maxisorp平板上。用PBS-T (PBS，0.1%吐温20)洗涤平板三次并在室温下通过PBS-T中的0.5% BSA封闭30分钟。随后，将h2B6-h3G8CBD、h2B6CMD或h3G8CMD以两倍系列稀释稀释到封闭缓冲液中以产生0.5 μ g/ml至0.001 μ g/ml范围内的双抗体浓度。然后在室温下孵育平板I小时。用PBS-T洗涤三次后，将50 μ I/孔的0.2 μ g/mls⑶16Α-生物素加至每个孔。再次在室温下孵育平板I小时。用PBS-T洗涤三次后，将50 μ I/孔的1: 5000稀释的HRP偶联的链霉亲和素(Amersham Pharmacia Biotech)用于检测。允许HRP-链霉亲和素在室温下孵育45分钟。用PBS-T洗涤平板三次并用80 μ I/孔的TMB底物显色。孵育10分钟后，通过加入40 μ I/孔的10A H2SO4终止HRP-TMB反应。使用96-孔读板机和SOFTmax软件读取0D450nm并使用GraphPadPri sm3.03软件对结果作图。
[0630]BIAcore测定:使用如5.4.3节中描述的BIAcore测定(BIAcore仪器1000，BIAcore Inc.,Piscataway7N.J.)和相关软件分析所洗脱和纯化的双抗体的结合的动力学参数。
[0631]将SCD16A、sCD32B或sCD32A(阴性对照)通过胺偶联化学法(通过用NHS/EDC混合物修饰羧甲基基团)固定在传感器芯片表面的四个流动池中的一个(流动池2)上使得约1000反应单位(RU)的任何一种受体被固定在所述表面上。在这之后，通过注射IMEt-NH2将未反应的活性酯“脱帽”。一旦制备了合适的表面，通过以70mL/min的流速注射6.25-200nM的溶液180秒钟使共价双特异性双抗体(h2B6_h3G8CBD)或共价单特异性双抗体(h2B6CMD或h3G8CMB)在所述表面经过。还测试了 h3G8scFv以便比较。
[0632]—旦收集到整套数据,使用由制造商BIAcore, Inc.(Piscataway, NJ)提供的计算机算法对所得到的结合曲线全局拟合。这些算法计算了 Kgg和Kws，从它们推断出表观平衡结合常数，Kd被推算为这两个速率常量的比(即，KWiS/Kgg)。对如何获得各个速率常量的更详细的处理可在 BIAevaluaion Software Handbook (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)中发现。
[0633]单独地拟合结合和离解阶段。对于ISOsec离解阶段的间隔32_34SeC获得离解速率常数；通过1:1Langmuir模型获得结合阶段拟合并基于双特异性双抗体和scFv的基础Rfflax和X 2标准选择基础拟合；二价分析物拟合被用于CMD结合。
[0634]结果
[0635]非还原条件下的SDS-PAGE分析表明h3G8CMD、h2B6CMD和h2B6_h3G8CBD表达系统的纯化产物各自是具有约50kDa的估计分子量的单一物质(分别是图3的泳道4、5和6)。在还原条件下，从任何一种CMD表达系统纯化的产物跑成单一条带(泳道I和2)，而从h2B6-h3G8CBD系统纯化的产物表明是2种单独的蛋白质(图3，泳道3)。从该表达系统中纯化并通过还原条件下的SDS-PAGE观察到的所有多肽迁移至约28kDa。
[0636]每种表达系统的产物的SEC分析也表明为单一分子的物质(图4B)，其每一种在与IgG的Fab片段(〜50kDa)大致相同的时间被洗脱出来(图4A)。结果表明对于CMD表达系统的情况，亲和纯化的产物为均一的共价同二聚体而对于h2B6-h3G8CBD的情况为均一的共价异二聚体。
[0637]使用ELISA夹心测定测试h2B6_h3G8CBD结合CD32B和/或CD16A中的任何一者或二者的特异性(图5)。⑶32B用作靶抗原而⑶16A用作第二探针。ELIZA中的阳性信号表明异二聚体h2B6-h3G8CBD具有对两种抗原的特异性。h3G8CMD的相似测试(其不应结合⑶32B)未显示出信号。
[0638]SPR分析表明h3G8CMD免疫特异性地识别s⑶16而非s⑶32B，h2B6CMD免疫特异性地识别s⑶32B而非s⑶16，且h2B6-h3G8CBD免疫特异性地识别s⑶16和s⑶32B 二者(图6A-B)。所测试的这些双抗体都不结合对照受体s⑶32A(图6C)。
[0639]还使用SPR分析来估计CMD和h2B6_h3G8CBD与sCD16和/或sCD32B的动力学常数和平衡常数。将结果与对h3G8scFV计算的相同常数比较。图7A-E示出了 SPR分析的图形结果。从图7中所示的结果计算的动力学结合和解离速率以及平衡常数被提供在表13中。
[0640]表13从BIAcore数据计算的动力学常数和平衡常数。
[0641]
[0642]结合ELISA分析的结果，这些研究确认了 h2B6_h3G8共价异二聚体保留了对⑶32B和CD16的特异性且能够同时结合两种抗原。图8中图示地呈现了该分子。
[0643]6.2包含Fe结构域的共价双特异性双抗体的设计和表征
[0644]试图制备IgG样分子即，包含Fe结构域的分子时，构成实施例6.1中呈现的异二聚体CBD分子的多肽之一被修饰为还包含Fe结构域(产生与抗体的重链和轻链类似的‘较重’和‘较轻’的链)。然后该异二聚体双特异性分子将包含将与同源分子二聚化的Fe结构域，形成具有四价的四聚IgG样分子(即，通过异二聚体双特异性分子的Fe结构域的二聚化而形成)。有趣的是，使用功能测定未在重组表达系统的条件培养基中检测到这些四聚体分子，所述功能测定例如，测试条件培养基对靶抗原的免疫特异性结合。代替地，仅在这些功能测定中检测到包含由VL、VH和Fe结构域组成的单体的二聚体分子。为测试理论上四聚的结构的稳定性是否是受争议的，将包含Fe结构域的多肽构建为还包含铰链区，同时包含‘较轻的’链的多肽被构建为还包含人K轻链的恒定结构域的6个C末端氨基酸。当这些重构的‘较重’和‘较轻’的链在重组表达系统中共表达时，功能测定检测到能够免疫特异性地结合靶抗原以及抗Fe抗体二者的双抗体分子。
[0645]材料和方法
[0646]多肽分子的构建和设计:设计核酸表达载体以产生实施例6.1中提供的构建体I和2的修饰形式。通过分别构建构建体I和2以还包含Fe结构域来创建构建体5 (SEQ IDNO: 14)和6 (SEQ ID NO: 15)。通过构建构建体I以在其C末端还包含序列FNRGEC (SEQ IDNO:23)来创建构建体7 (SEQ ID NO:16)。通过构建构建体2以还包含铰链区和Fe结构域(包含V215A突变)来创建构建体8 (SEQ ID NO: 18)。图9中示出了构建体5_8的图示呈现。
[0647]PCR和表汰载体的构津:实施例6.1中描述了所有PCR及PCR产物纯化方案。质粒pMGX0669和pMGX0667分别用作构建体I和2的编码序列的模板。HuIgG Fe结构域和/或铰链结构域的编码序列分别为SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:5。使用正向和反向引物扩增模板DNA的编码序列使得PCR产物将包含重叠序列，允许重叠PCR产生期望产物的编码序列。
[0648]分别使用正向和反向引物SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:62从pMGX0669扩增构建体I的编码序列。分别使用正向和反向引物SEQ ID N0:55和SEQ ID NO:63从pMGX0667扩增构建体2的编码序列。分别使用正向和反向引物SEQ ID N0:65和SEQ ID NO:66扩增HuIgG铰链-Fe。使用正向和反向引物SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:67从pMGX0669扩增构建体 7 (SEQ ID NO:16)。
[0649]重叠PCR:如下所述地合并初始PCR产物，如实施例6.1中所述地扩增并纯化。
[0650]通过合并扩增构建体I和HuIgG Fe的PCR产物和分别为SEQ ID NO:55和SEQID N0:64的正向和反向引物扩增编码构建体5SEQ ID NO: 14 (图9中图示地示出的)的核酸序列。通过合并扩增构建体2和HuIgGFc的PCR产物和分别为SEQ ID NO:55和SEQ IDNO:66的正向和反向引物扩增编码构建体6SEQ ID NO: 15 (图9中图示地示出的)的核酸序列。通过合并扩增构建体2和HuIgG铰链-Fe的PCR产物和分别为SEQ ID NO:55和SEQID NO:66的正向和反向引物扩增编码构建体8SEQ ID NO: 18 (图9中图示地示出的)的核酸序列。
[0651]如上所述地将最终产物克隆到pCIneo哺乳动物表达载体(Promega, Inc.)中。如表14中标示的，命名了编码构建体的质粒:
[0652]表14.质粒构建体
[0653]
[0654]多狀/双杭体表汰:如6.1节所描述的使用Lipofectamine2000对HEK-293细胞进行四次单独的共转染:分别编码构建体I和构建体6的pMGX0669和pMGX0674 ;分别编码构建体2和构建体5的pMGX0667和pMGX0676 ;和分别编码构建体7和构建体8的pMGX0677和 pMGX0678。
[0655]这些质粒的共转染被设计成导致对Fe Y RIIB和Fe YRIIIA 二者具免疫特异性的具有IgG样结构的四价双特异性双抗体(CBD)的表达。还进行了另外的共转染:分别编码构建体6和构建体5的pMGX0674和pMGX0676。培养三天后，收集条件培养基。使用纯化的Fe作为标准通过抗IgG Fe ELISA对条件培养基中分泌产物的量定量。然后基于定量对样品中产物的浓度标准化，并将标准化的样品用于其余的测定。
[0656]ELISA:如上文所沭地通过夹心ELISA测定分泌到培养基中的双抗体分子的结合。除非被指出，CD32B被用来包被平板，即作为靶蛋白，且HRP-偶联的CD16用作探针。
[0657]结果
[0658]使用ELISA测定测试来自包含构建体I和6 (pMGX669_pMGX674)、构建体2和5(pMGX667-pNGX676)及构建体5和6 (pMGX674_pMGX676)的重组表达系统的标准化样品中能够同时结合⑶32B和⑶16A的双抗体分子的表达(图10)。ELISA数据表明共转染构建体I和6或共转染构建体2和5不能产生能够结合任一种或两种抗原的产物(图10，分别为□和▲)。但是，共转染构建体5和6导致分泌能结合⑶32B和⑶16抗原二者的产物。后一种产物是包含针对每种抗原的一个结合位点的构建体5和6的二聚体，结构被图示地描绘在图11中。
[0659]为了驱使IgG样异四聚体结构的形成，将6个额外的氨基酸的编码序列附接在构建体I的C末端，产生构建体7 (SEQ ID NO:16并被图示地示出在图9中)。6个额外的氨基酸，FNRGEC(SEQ ID N0:23)，衍生自κ轻链的C末端，并通常与IgG分子中重链的上铰链结构域相互作用。然后将铰链结构域构建到构建体6中，产生构建体8 (SEQ ID Ν0:18和图9)。构建体8另外在上铰链结构域包含氨基酸突变A215V。然后将分别编码构建体7和构建体8的表达质粒pMGX677和pMGX678共转染到HEK-293细胞中并如所述地表达。
[0660]在ELISA测定中比较由包含构建体7和8 (pMGX0677+pMGX0678)的重组表达系统产生的双抗体分子与由包含构建体I和6 (pMGX669+pMGX674)、构建体2和8 (pMGX669+pMGX678)及构建体6和7的(pMGX677+pMGX674)的重组表达系统产生的双抗体分子对⑶32B和⑶16A的结合(图12)。[0661 ] 像之前一样，由包含构建体I和6 (pMGX669+pMGX674)的表达系统产生的分子被证明不能结合⑶32A和⑶16A(图10和图12)。相比而言，来自构建体7和
6(pMGX0677+pMGX0674)的共表达或来自构建体7和8 (pMGX0677-pMGX0678)的共表达的产物能够结合CD32B和CD16 二者(图12)。值得注意的是除了构建体7包含C末端序列FNRGEC (SEC ID NO:23)之外，构建体7与构建体I类似；并且除了构建体8包含铰链结构域和突变A215V之外，构建体8与构建体6类似。数据表明将来自C- K轻链的C末端的6个额外的氨基酸(FNRGEC;SEQ ID NO:23)加至不具有Fe的‘较轻’的链有助于稳定四聚体IgG样双抗体分子的形成，无论相应的较重的链是否包含铰链结构域(即，pMGX0677+pMGX0674和pMGX0677-pMGX0678，图12)。将铰链结构域加至具有Fe的‘较重’的多肽，而未将FNRGEC(SEQ ID NO:23)C末端序列加至相应的‘较轻’的链明显地不能实现相似的稳定(即，缺乏构建体2和8(pMGX669+pMGX678)共转染的产物的结合)。图13中图示地示出了四聚体双抗体分子的结构。
[0662]6.3结构域顺序和额外的二硫键对四聚体IgG样双抗体的形成的作用
[0663]通过用半胱氨酸置换多肽链上所选择的残基研究四聚体IgG样双抗体分子的‘较轻’和‘较重’的多肽链之间的额外的稳定的作用。该额外的半胱氨酸残基提供‘较轻’和‘较重’链之间的额外的二硫键。另外，通过将Fe结构域或铰链-Fe结构域从多肽链的C末端移到N末端研究结构域顺序对结合活力的影响。虽然包含额外的二硫键的分子的结合活力相对于具有这些键的之前构建的双抗体分子没有改变，但是将Fe或铰链-Fe结构域转移到构成双抗体的‘较重’的多肽链的N末端令人惊奇地提高了双特异分子对其靶抗原中之一或二者的结合亲和力或亲合力。
[0664]材料和方法[0665]多肽分子的构建和设计:设计核酸表达载体以产生实施例6.2中提供的构建体5，6和8的修饰形式。除了 Fe结构域或铰链-Fe结构域分别被从多肽链的C末端转移到N末端之外，构建体9 (SEQ ID NO:19)和构建体10 (SEQ ID NO:20)(都被图示地示出在图13中)与构建体8和6类似。另外，所使用的所有Fe结构域都是野生型IgGl的Fe结构域。除了 C末端被设计为还包含序列FNRGEC(SEQ ID NO:23)之外，构建体IlSEQ ID NO:21(被图示地示出在图14中)与来自实施例6.1的构建体2类似。除了 Fe结构域还包含铰链区之外，构建体12SEQ ID NO:22(被图示地示出在图14中)与来自实施例6.2的构建体5类似。另外，对于构建体11和12，2B6VL结构域和2B6VH结构域包含单氨基酸修饰(分别是G105C和G44C)使得每个结构域中的甘氨酸被半胱氨酸取代。
[0666]PCR和表汰载体的构律:所有PCR和PCR产物纯化方案如实施例6.1和6.2中所述。
[0667]重叠PCR:使用实施例6.1和实施例6.2中描述的方法构建、扩增和纯化最终产物。
[0668]如前所述地将最终产物克隆到pCIneo哺乳动物表达载体(Promega, Inc.)中。如表15中标示的,命名了编码构建体的质粒:
[0669]表15.质粒构建体
[0670]
[0671]多肽/双抗体的表汰:如6.1节中所描述的，使用Lipofectamine2000对HEK-293细胞进行三次单独的共转染:分别编码构建体I和构建体9的pMGX0669和pMGX0719 ;分别编码构建体I和构建体10的pMGX0669和pMGX0718 ;和分别编码构建体11和构建体12的PMGX0617和pMGX0717。这些质粒的共转染被设计成导致对Fe y RIIB和Fe y RIIIA 二者具免疫特异性的具有IgG样结构的四价双特异性双抗体(CBD)的表达。培养三天后，收集条件培养基。使用纯化的Fe作为标准通过抗IgG Fe ELISA对条件培养基中分泌产物的量定量。然后基于定量对样品中产物的浓度标准化，并将标准化的样品用于其余的测定。
[0672]ELISA:如上文所沭地通过夹心ELISA测定分泌到培养基中的双抗体分子的结合。除非被指出，CD32B被用来包被平板，即作为靶蛋白，且HRP-偶联的CD16用作探针。
[0673]蛋白质印迹:通过非还原条件下的SDS-PAGE分析来自上述3次共转染的约15ml条件培养基。用Simply Blue Safestain(Invitrogen)对一块凝胶染色并使用标准的转移方法将另一块相同的凝胶转移到PVDF膜(InvitiOgen)上。转移后，用IX PBS中的5%脱脂乳封闭膜。然后在温和搅拌下，在IOml的在1XPBS/0.1%吐温20中的2%脱脂乳中的1: 8，000稀释的HRP偶联的山羊抗人IgGlH+L中室温孵育膜I小时。接下来用1XPBS/0.3%吐温20洗涤两次，每次5分钟，然后室温20分钟，用ECL蛋白质印迹检测系统(Amersham Biosciences)根据厂家说明对膜显色。胶片在X射线处理器中显影。
[0674]结果
[0675]通过SDS-PAGE(在非还原条件下)分析和蛋白质印迹分析(使用抗IgG作为探针)分析来自包含构建体I和9、构建体I和构建体10，以及构建体11和12的重组表达系统的条件培养基。蛋白质印迹表明来自包含构建体11和12或包含构建体9和I的系统的产物主要形成约150kDa的单一分子物质(分别是图14的泳道3和2)。这两种产物都具有在构成双抗体的‘较轻’和‘较重’的链之间的构建的内部二硫键。相比而言，不含在‘较轻’和‘较重’的链之间的构建的内部二硫键的由构建体10和I形成的分子形成至少两种分子量为〜75和〜IOOkDa的分子物质(图14，泳道I)。
[0676]不管蛋白印迹分析的结果，发现3种产物中的每一个都能够结合CD32A和CD16(图15)。令人惊奇的是，相对于包含C末端铰链-Fe结构域的产物(由构建体11和12形成)，来自其中Fe (或Fe铰链)结构域在包含Fe的多肽链(S卩，‘较重’的链)的N末端的两种系统的产物(构建体9+1和构建体10+1)表现出增强的对其祀肽中之一或二者(即CD32B和/或CD16)的亲和力和/或亲合力。
[0677]6.4内部/外部裂解位点对多蛋白前体的加工和共价双特异双抗体的表达的影响；包含人IgG λ链和铰链结构域的部分的双特异性双抗体的设计和表征
[0678]如本文所述，本发明的双抗体或双抗体分子的单条多肽链可表达为单一的多蛋白前体分子。通过构建编码被内部裂解位点，特别地，弗林蛋白酶裂解位点隔开的CBD的第一和第二多肽链的核酸，测试实施例6.1-6.3中描述的重组系统从该多蛋白前体合适地加工和表达功能性CBD的能力。从包含多蛋白前体分子的重组系统分离功能性CBD。
[0679]如在实施例6.3中所讨论的，发现来自人Y轻链的6个C末端氨基酸FNRGEC (SEQID NO:23)的添加稳定双抗体的形成-可能通过包含SEQ ID NO:23的结构域和包含Fe结构域或铰链-Fe结构域的那些结构域之间的增强的链间相互作用。在CBD中测试该λ链/Fe样相互作用的稳定作用，其中任一多肽链都不含Fe结构域。双抗体的一条多肽链被构建为在其C末端包含SEQ ID NO:23 ;其配偶体多肽链被构建为包含衍生自IgG的铰链结构域的氨基酸序列VEPKSC (SEQ ID NO:77)。该CBD与由构建体I和2 (来自实施例6.1)构成的CBD的比较表明包含衍生自铰链结构域和λ链的结构域的CBD显示出稍高的对其靶表位中之一或二者的亲和力。`
[0680]材料和方法
[0681]多肽分子的构建和设计:多蛋白前体:核酸表达载体被设计为产生都被图示地呈现在图17中的2种多蛋白前体分子。构建体13(SEQ ID NO:95)从多肽链的N末端起包含，3G8的VL结构域、2.4G2(其结合mCD32B)的VH结构域、弗林蛋白酶裂解位点、2.4G2的VL结构域和3G8的VH结构域。编码构建体13的核苷酸序被提供在SEQ ID NO:96中。构建体14 (SEQ ID NO:97)(图17)从多肽链的N末端起，包含3G8的VL结构域、2.4G2(其结合mCD32B)的VH结构域、弗林蛋白酶裂解位点、FMD ( 口蹄疫病毒蛋白酶C3)位点、2.4G2的VL结构域和3G8的VH结构域。编码构建体14的核苷酸序被提供在SEQ ID NO:98中。
[0682]设计核酸表达载体以产生实施例6.1中提供的构建体I和2的修饰形式。除了构建体15的C末端包含氨基酸序列FNRGEC (SEQ ID NO:23)之外，构建体15 (SEQ ID NO:99)(图17)与实施例6.1中提供的构建体I (SEQ ID NO:9)类似。编码构建体15的核酸序列被提供在SEQ ID NO:100中。除了构建体16的C末端包含氨基酸序列VEPKSC(SEQ ID NO:77)之外，构建体16 (SEQ ID NO:101)(图17)与实施例6.1中提供的构建体2类似。编码构建体16的核酸序列被提供在EQ ID NO:102中。
[0683]PCR和表汰载体的构律:所有PCR和PCR产物纯化方案如实施例6.1和6.2中所述。[0684]重叠PCR:使用实施例6.1和6.2中描述的方法用合适的引物构建、扩增和纯化最终产物。
[0685]如前所述的，将最终产物克隆到pCIneo哺乳动物表达载体(Promega, Inc.)中。如表16中标示的，命名了编码构建体的质粒:
[0686]表16.质粒构建体
[0688]多狀/双杭体的表汰:如6.1节所描述的，使用Lipofectamine2000对HEK-293细胞进行一次转染和一次共转染:单转染:编码构建体13的pMGX0750 ;和共转染:分别编码构建体15和构建体16的pMGX0752和pMGX0753。培养三天后，收集条件培养基，如所述的亲和纯化分泌的产物。
[0689]ELISA:通过如上文描沭的夹心ELISA测定分泌到培养基中的双抗体分子的结合。鼠⑶32B被用来包被平板，即作为靶蛋白，且HRP-偶联的⑶16A用作针对构建体15和16的共转染产物的探针。mCD32B用作靶蛋白，且生物素-偶联的CD16A用作针对包含构建体13的重组系统的探针。
[0690]结果
[0691]通过夹心ELISA分析来自包含构建体13的重组表达系统的条件培养基。ELISA测定测试CBD结合mCD32B和/或⑶16中的任何一种或两种的特异性(图18)。⑶32B用作靶抗原而CD16A用作第二探针。ELISA中的阳性信号表明从多蛋白前体产生的异二聚体h2.4G2-h3G8CBD具有针对两种抗原的特异性。
[0692]相似地，在ELISA测定中测试通过共转染编码构建体15和16的载体产生的纯化后的产物并与包含构建体I和2的产物比较(实施例6.1)。⑶32B用作靶抗原而⑶16A用作第二探针。发现与包含构建体I和2的产物一样，构建体15和16的产物能够同时结合⑶32B和⑶16A。实际上，构建体15和16的产物显示出稍微增强的对靶抗原即，⑶32B或⑶16A中的一个或两个的稍微增强的亲和力。这可能是由于通过λ链区域FNRGEC(SEQ IDNO:23)和铰链区VEPKSC(SEQ ID NO:77)的相互作用所提供的链间缔合的增加的稳定性和或保真性(相对于野生型VH-VL结构域的相互作用)，这在包含构建体I和2的产物中不存在。
[0693]6.5使用双亲和力再靶向试剂(“DART”)将多重亲和力联系在一起
[0694]本发明的一个方面涉及新型双亲和力再靶向试剂(“DART”)及将多重亲和力联系在一起的新方法。“DART”可以是单特异性、双特异性、三特异性的等，从而能够同时结合一个、两个、三个或更多个不同的表位(其可以是相同或不同抗原的表位)。另外“DART”可以是单价、二价、三价、四价、五价、六价的等，从而能够同时结合一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个分子。如图35所示，DART的这两个属性可以结合到一起，例如以产生为四价的双特异性抗体等等。
[0695]一种进展是开发了具有对原型免疫受体huCD32B的亲和力，以及对半抗原荧光素的亲和力的DART。该DART称为“2B6/4420”，用作通用衔接子，能够将hu⑶32B和与荧光素-偶联的结合配偶体相互作用的分子共连接在一起。CD32B是具有由于与活化信号传导免疫复合体簇集而猝灭活化信号的能力的Fe受体。在其最初的实施中，该技术允许快速地筛选与hu⑶32B簇集的多种生物靶而不需要产生新的DART构建体。可将2B6/4420与针对细胞表面受体的荧光素化的抗体简单地混合并从而模拟具有对该受体的亲和力的DART的作用(图20)。另外，该试剂允许不易表达或制备的亲和试剂的有效连接，允许人们克服技术缺陷。包含2B6/4420的DART作为研究工具且还作为临床候选药物明显是有用的。从HEK293细胞产生的2B6/4420可在ELISA测定中同时结合CD32B和荧光素。另外，它可通过经与⑶79共连接将⑶32B召集到BCR复合体来抑制细胞增殖。DART的2B6臂可被不同的抗体序列或具有其他相关特异性的结合序列所取代。
[0696]材料和方法:
[0697]质粒构建体:2B6/4420衍生自人源化的2B6Mab (hu2B6, MGA321)和嵌合小鼠Fv/人Fe形式的抗荧光素Mab4420的序列。完整组装的DART由两条多肽链组成，导致两个Fv区域的共价连接。第一个多肽链由以下组成:分泌信号序列，其后面是被产生为与4420VH的融合蛋白的hu2B6VL，4420VH与hu2B6VL被由氨基酸残基GGGSGGGG组成的接头隔开。衍生自K轻链C末端的序列FNRGEC被附接到该多肽链的C末端。另一条多肽由信号序列-4420VL-GGGSGGGG-hu2B6VH组成，衍生自人IgGlFd片段的C末端的序列VEPKSC附接在C末端。两条链中的半胱;氣酸形成二硫键，将两条多妝链共价连接在一起(图20)。从现有质粒PCR扩增编码所描述的多肽的DNA序列，通过重叠PCR组合并在NheI和EcoRI位点之间克隆到pCIneo (Promega)中。最后，之前使用与上述方法相似的方法构建的具有对huCD32B和huCD16的亲和力的DART (2B6/3G8)用作对照。
[0698]抗体:鼠单克隆抗体抗人CD79b、CB3.1和CB3.2 (杂交瘤)从Dr.Cooper MD，位于Birmingham 的 University of Alabama,Birmingham AL.处获得。根据厂家说明(Pierce,Rockford IL)用异硫氰酸荧光素(FITC)标记CB3.1和CB3.2。Fe片段特异性的山羊抗小鼠(GAM) IgG 的 F (ab，)2 片段从 Jackson Laboratories (West Grove, PA)获得。抗 huCD32B小鼠Mab即3H7在内部制备并纯化。山羊抗2B6Fv通过用hu2B6完整抗体免疫山羊并针对hu2B6的Fv区域亲和纯化产生。HuIgG, FITC-huIgG和HRP-抗-小鼠IgG从JacksonImmunoresearch 获得。HRP-抗山羊从 Southern Biotech 获得。
[0699]DART表达:使用Lipofectamine2000 (Invitrogen)根据厂家说明将编码每条链的质粒共转染到293H细胞(Invitrogen)中。以三天为间隔收集分泌的蛋白质3_4次并通过针对固定的CD32B可溶性形式的液相层析进行纯化。
[0700]ELISA:2B6/420 或 2B6/3G8DART 被捕获在包被有 FITC-标记的蛋白 S(Novagen)、人IgG或FITC-huIgG的MaxiSorp平板(Nalge Nunc)上。检测通过结合可溶性CD32B的外结构域，接下来是3H7(CD32B特异性的小鼠单克隆抗体)且最后是抗_小鼠-HRP而进行。可替代地，检测通过结合山羊抗-2B6FV多克隆亲和纯化的抗血清，接下来是抗-山羊-HRP而进行。使用比色TMB底物(BioFX)检测HRP活性并在VersaMax ELISA读板机上读数。
[0701]B细胞纯化和增殖测定:使用来自健康供体的血液通过Ficoll/PaquePlus (Amersham Pharmacia Biotech, UK)梯度法分离外周血单核细胞。使用 Dynal B CellNegative Isolation Kit (Dynal Biotechnology Inc.,NY)根据厂家说明分离B淋巴细胞。如通过FACS分析估计的，所分离的B细胞(⑶20+)的纯度大于90%。对于增殖测定，将纯化的B细胞以每孔IxlO5个细胞的密度以200 μ I终体积接种在平底96孔微量滴度板上的完全RPMI1640培养基中并在37°C，5% CO2中，在存在或不存在抗体和双抗体下孵育48小时。然后加入I μ Ci/孔的[3H]胸苷(Perkin Elmer,Wellesley,MA)并在收获前继续培养另外的16-18小时。通过液体闪烁计数测量[3H]胸苷掺入。
[0702]结果
[0703]为了证实2B6/4420DART是有活性的且是特异性的，进行了 2次ELISA实验。首先，将2B6/4420或2B6/3G8 (作为阴性对照)结合到已被包被到ELISA平板上的荧光素-偶联的蛋白(S-蛋白)上。下一步，通过可溶性⑶32B接合DART的2B6臂。通过针对CD32B的不与2B6的表位重叠的表位的另一种抗体，接下来是HRP-偶联的二抗来检测结合。2B6/4420DART能够同时结合荧光素和CD32B, 2B6/3G8则不能(图21，图A)。当DART被捕获在包被有可溶性⑶32B的平板上并通过hu2B6特异性抗体检测结合时，两种DART显示出良好的结合。为证实2B6/4420DART能够结合偶联到人IgG上的荧光素(考虑到这是初步使用该试剂的环境)，未标记或标记了荧光素的HuIgG被结合到ELISA平板上并用来捕获2B6/4420。再一次地，2B6/3G8用作阴性对照。使用Hu2B6Fv特异性抗体检测结合。2B6/4420DART清楚地结合FITC-HuIgG，但是不结合未标记的HuIgG，表明该DART能够结合偶联到抗体的荧光素且不明显地结合单独的抗体。如所预料的，在这些环境中的任一种环境下都没有检测到的2B6/3G8DART的结合。
[0704]进行实验以证实2B6/4420DART能够充当可在基于细胞的测定环境中对信号传导产生影响的双亲和力试剂。 已表明CD32B与BCR的共聚集抑制B细胞的活化。探索了2B6/4420DART将⑶32B和包被有标记了荧光素的α⑶79b抗体的BCR共接合在一起并触发对细胞增殖的抑制的能力。B细胞被从人血中负选择并通过用渐增浓度的小鼠抗-人CD79b-FITC标记的克隆CB3.1和CB3.2处理，并通过加入Fe特异性GAM的F (ab’)2片段作为第二试剂以交联BCR，连同固定浓度(5yg/mL)的2B6/4420DART或等量的2B6/3G8DART ( —种不靶向荧光素的分子，因此用作对照)来活化。在不存在DART或存在对照2B6/3G8DART的情况下，被测量为[3H]-胸苷掺入的细胞增殖随着单克隆抗-CD79b-FITC活化剂的浓度的增加而增加。2B6/4420DART的存在在抗人⑶79b_FITC的所有浓度下致使B细胞增殖严重减少(图22，图A和B及图23，图A)。
[0705]当包被有未标记的CB3.2并使用相同的实验条件激活的B细胞用2B6/4420DART处理时未观察到对增殖的抑制，证明其靶特异性(图23，图B)。这些数据证实2B6/4420DART能够交联CD32B和BCR并传递能够阻断抗原_受体_诱导的细胞活化的抑制信号。
[0706]6.6针对表达⑶32B的B细胞恶性肿瘤的DART免疫治疗
[0707]目前，B细胞恶性肿瘤使用RituxanCi^ -⑶20抗体来治疗。但是一些B细胞恶性肿瘤不表达CD20或变得耐受Rituxano本发明的DART提供了能够克服与Rituxan⑩抗-CD20抗体相关的问题的替代免疫治疗。
[0708]MGD261 是结合 hCD32B (通过 h2B6 抗体)及 hCD16A 和 hCD16B (通过 h3G8 抗体)的双亲和力再靶向(DART)分子。
[0709]在mCD32-/-hCD16A + C57Bl/6、mC D 3 2 - / - h C D 3 2 B + C 5 7 B I / 6 和mCD32-/-hCD16A+hCD32B+C57Bl/6中测试MGD261的功效(B细胞去除)和安全性。在该重复剂量实验中，小鼠接受6次IV注射(一周两次持续三周)。通过FACS监测B细胞去除。通过笼边观察监测安全性。
[0710]数据表明MGD261能够去除双转基因小鼠中的B细胞而不引起任何明显的副作用。
[0711]数据:在第0、3、7、10、14和17天时对来自MacroGenics繁殖群的mCD32-/-hCD16A+C57Bl/6、mCD32-/_hCD32B+C57Bl/6 和 mCD32-/_hCD16A+hCD32B+C57Bl/6小鼠IV注射MGD261(10、3、1或0.3mg/kg)或无关抗体(hE1610mg/kg)。在第-19 (取血前)、4、11、18、25和32天收集血液以便FACS分析。每周三次地记录动物的健康和活动。
[0712]设计:
[0714]FACS分析方法:在施用h2B6-h3G8前的第18天和处理后的第4、11、18、25和32天收集全血样品。分析血液样品以通过基于FACS的测定确定h2B6-h3G8对B细胞计数的影响。通过使用从Beckman Coulter获得的FlowCount珠,对B细胞、T细胞、PMN计数使用非洗涤方案。该分析中使用的抗体的组是:对于PMN为1A8-FITC，对于T细胞为⑶3-PE，对于B细胞为⑶19-APC及对于总的白细胞为⑶45-PerCP。
[0715]结果
[0716]用hE16或MGD261 (以任何浓度)处理的小鼠在实验过程中的任何时间没有显示出任何不适的迹象。
[0717]在h⑶16A和h⑶32B双转基因小鼠中观察到B细胞去除。双抗体h2B6_3G8接合表达h⑶16A的效应细胞和表达h⑶32B的B细胞；这些接合是B细胞杀伤所需要的。未在单转基因小鼠中观察到B细胞去除(图24)。在研究期间没有T细胞和PMN水平的明显变化。
[0718]作为对本发明的替代免疫治疗剂的进一步证实，构建了称为“2.4G2-3G8DB”的MGD261 的代替物。2.4G2-3G8DB 是结合 mCD32B (通过 2.4G2 抗体)及 hCD16A 和 hCD16B (通过h3G8抗体)的双亲和力再靶向(DART)分子。
[0719]在mCD16-/-、mCD16-/-hCD16A + C57Bl/6、mCD16-/-hCD16B+ 和mCD16-/-hCD16A+hCD16B+小鼠中测试2.4G2-3G8DB的功效(B细胞去除)和安全性。在该重复剂量实验中，小鼠接受9次IP注射(一周三次持续三周)。通过FACS监测B细胞去除。通过笼边观察监测安全性。
[0720]数据表明2.4G2-3G8DB能够去除h⑶16转基因小鼠中的B细胞而不引起任何明显的副作用。
[0721]数据:在第0、2、4、7、9、11、14、16和18天时对来自MacroGenics繁殖群的mCD16-/-、mCD16-/-hCD16A+C57Bl/6、mCD16-/_hCD16B+ 和 mCD16-/_hCD16A+hCD16B+ 小鼠IP注射2.4G2-3G8DB(75yg/小鼠)或PBS。在第-10 (取血前)、4、11和18天收集血液以便FACS分析。每周三次地记录动物的健康和活动。
[0722]
[0723]FACS分析方法:在施用2.4G2-3G8前的第10天和开始治疗后的第4、11和18天收集全血样品。分析血液样品以通过基于FACS的测定确定2.4G2-3G8对B细胞计数的影响。通过使用从BD Immunocytometry System获得的TruCOUNT管，对B细胞、T细胞、PMN计数使用非洗涤方案。该分析中使用的抗体的组是对于PMNl为1A8-FITC，对于T细胞为CD3-PE，对于B细胞为CD19-APC及对于总的白细胞为CD45_PerCP。
[0724]结果
[0725]用hE16或2.4G2-3G8DB处理的小鼠在实验过程中的任何时间没有显示出任何不适的迹象。
[0726]在mCD16-/-hCD16A+ 或 mCD16-/-hCD16A+hCD16B+ 小鼠中观察到 B 细胞去除，但未在mCD16-/_小鼠中观察到。这些数据表明携带hCD16A的效应细胞是B细胞杀伤所需要的(图25)。在研究期间没有T细胞和PMN水平的明显变化。
[0727]静脉内(IV)模型:使用人肿瘤细胞系Raji的静脉内(IV)模型测试MGD261的抗肿瘤活性。Raji是表达h⑶32B的人伯基特淋巴瘤细胞系。当被静脉注射到mCD16-/-、hCD16A+、RAGl-/-小鼠中时，肿瘤细胞定位到脊柱并导致后腿瘫痪。
[0728]数据表明MGD261能够阻碍mCD16_/-、hCD16A+、RAGl-/-小鼠中Raji肿瘤细胞在体内的生长。数据表明MGD261可用于治疗人类的表达⑶32B的B细胞恶性肿瘤。
[0729]数据:在第O天对来自MacroGenics繁殖群的12-20周龄的mCD16_/-、hCD16A+、RAG1-/-C57B1/6 小鼠 IV 注射 5xl06 的 Raji 细胞。在第 6、9、13、16、20、23、27 和 30 天时，另外用250、25或2.5ug的MGD261或用PBS(阴性对照)腹膜内(IP)处理小鼠。然后每天观察小鼠并一周两次地记录体重。处死发展后腿瘫痪的小鼠。
[0730]结果:用PBS处理的小鼠在25天和50天之间死亡。用MGD261处理的小鼠至少存活到第90天(图26)。增加的存活率是统计学上显著的。使用Logrank检验比较存活曲线得出 X 2 为 96.46 (df9 ；P 值< 0.0001)。
[0731]6.7 DART在原核细胞中的表达
[0732]进行实验以证实在非哺乳动物宿主中产生DART的能力。因此，用DART表达质粒转化大肠杆菌，并检测DART表达。[0733]材料和方法:
[0734]质粒构建:3G8是针对Hu⑶16的人源化单克隆抗体。此处描述的DART由两条共价连接的链组成，其每条具有VL，后面为分隔物，然后是VH，后面为处于良好的环境中以与相对的链形成二硫键的Cys。从现有的真核细胞表达构建体PCR扩增编码3G8VL-GlyGlyGlySerGlyGlyGlyGly(SEQ ID NO:10)-3G8VH_LeuGlyGlyCys 的 DART 序列并用 Nco I 和 EcoRI消化。靶载体是pET25b (+) (Novagen)，其包含待分泌在大肠杆菌中的pelB前导序列。在插入3G8/3G8DART序列之前，对所述载体作了如下修饰:首先，T7启动子被较低活性的Iac启动子取代以有利于蛋白质在其控制下的虽然水平较低但可溶性的表达。另外，引入2个点突变以去除存在于多克隆位点(MCS)的起点处的两个内部Met密码子，以利于在存在于PelB前导序列开始处的Met起始。通过该构建体产生的DART由具有相同特异性，即Hu⑶16的两个V-区臂组成。
[0735]表达:用pET25b(+)T7_lac+3G8/3G8 质粒转化 BL21DE3 细胞(Novagen)并使用amp-抗性的集落接种肉汤培养物。当培养物达到0.50D600单位时，加入0.5mM IPTG来诱导表达。使培养物在30°C下生长2小时并收集无细胞培养基。
[0736]纯化:用亲和层析和尺寸排阻层析在两步骤方法中纯化3G8/3G8DART。使用亲和层析从条件培养基中捕获DART。特别地，⑶16A被偶联到CNBr活化的S印harose4B(GEHealthcare)上。在上样前将 CD16A-S印harose 树脂在 20mM Tris/HCl，ρΗ8.0 中平衡。上样完成后，用平衡缓冲液洗涤树脂，然后用50mM甘氨酸ρΗ3.0洗脱结合的DART之前。立即用IM Tris/HCl pH8.0中和所洗脱的DART并使用离心型浓缩器(Vivaspin20，IOk MWCOPES, VivaScience Inc.)浓缩。使用平衡在 PBS 中的 Superdex200 柱(GE Healthcare)通过尺寸排阻层析进一步纯化所浓缩的DART。
[0737]结果
[0738]通过⑶16A Se pharose柱处理1.7升的培养大肠杆菌的条件培养基。DART的产量是0.12mg。通过SDS-PAGE和SEC对纯化的DART的分析表明与哺乳细胞(CHO)表达的对照DART的可比性(图27)。
[0739]大肠杆菌表达的h3G8-h3G8DART 结合 ELISA:使用 ELISA 测量 h3G8_h3G8DART 在大肠杆菌中的表达。在碳酸盐缓冲液中，在4°c下将50 μ I/孔的2 μ g/ml的抗_h3G8Fv特异性抗体2C11过夜包被在96-孔Maxisorp平板上。在加入受试DART前，用PBS-T (PBS，0.1%吐温20)洗涤平板三次并然后在室温下通过PBS-T中的0.5% BSA封闭30分钟。在封闭期间，大肠杆菌表达的h3G8-h3G8DART、h2B6-h3G8DART和h2B6_h2B6DART (阴性对照)在PBST/BSA中被稀释到I μ g/ml和0.3 μ g/ml。将50 μ I/孔的稀释的DART加至每个孔。在室温下孵育平板I小时。用PBS-T洗涤三次后，将50 μ I/孔0.1 μ g/ml生物素化的s⑶16-Fc融合蛋白加入平板。在室温孵育平板I小时。用PBS-T洗涤三次后，使用50ul/孔的1: 5000稀释的HRP偶联的链霉亲和素(Amersham Pharmacia Biotech)检测并室温孵育I小时。用PBS-T洗涤平板三次并用80 μ I/孔的TMB底物显色。孵育5分钟后，通过40 μ I/孔的I % H2SO4终止反应。使用96-孔读板机和SOFTmax软件读取0D450nm。使用GraphPadPri sm3.03软件对读出值作图(图28)。
[0740]6.8 DART-诱导的人B-细胞死亡
[0741]将人PBMC与以下分子一起孵育过夜:CD16-CD32B-hu3G8-hu2b6(如上所述)；ch2B6-aglyc-去糖基化的嵌合2B6抗体(被描述在共同待决的美国专利申请序列号11/108，135，被公布为 US2005/0260213，通过引用并入本文)和 CD16-CD79。CD16-CD79 的DNA和所编码的蛋白质序列如下:
[0778]ccctgaagag ccgactgaca atctccaagg atacctccaa aaaccaggta 600
[0779]gtcctcacaa tgaccaacat ggaccctgtg gatactgcca catactactg 650
[0780]tgctcaaata aaccccgcct ggtttgctta ctggggccaa gggactctgg 700
[0781]tcactgtgag ctcattcaac aggggagagt gt732
[0782]氨基酸序列(SEQID NO:229):
[0783]DVVMTQTPLT LSVNIGQPAS ISCKSSQSLL DTDGKTYLNW LLQRPGQSPN 50
[0784]RLIYLVSKLD SGVPDRFTGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGI YYCffQGTHFP 100
[0785]LTFGAGTKLE LKGGGSGGGG QVTLRESGPA LVKPTQTLTL TCTFSGFSLS 150
[0786]TSGMGVGffIR QPPGKALEffL AHIffffDDDKR YNPALKSRLT ISKDTSKNQV 200
[0787]VLTMTNMDPV DTATYYCAQI NPAffFAYffGQ GTLVTVSSFN RGEC244
[0788]通过FACS分析测定凋亡，表示为B细胞的PI+膜联蛋白-V+群(⑶20+细胞)占总的FSC/SSC未门控的群的百分比(图29)。
[0789]6.9 8B5-CB3.1DART
[0790]8B5VL -CB3.1VH-VEPKSC
[0791]通过使用H9和lgh630R作为引物，ch8B5Lc作为模板扩增8B5VL。通过使用lgh628F和lgh630R作为引物，ch8B5Hc作为模板扩增CB3.1VH。在引物lgh630R和lgh628F中并入接头序列。c末端接头和终止密码子被并入到lgh629R引物中。凝胶纯化PCR产物用并以等摩尔比混合在一起，然后通过使用H9和lgh629R作为引物扩增。然后用Nhel/EcoRI限制性内切酶消化重叠PCR产物，并克隆到pCIneo载体中。
[0792]CB3.1VL-8B5VH-FNRGEC
[0793]通过使用在FR4处与8B5VL共有相同的序列的H9和lgh630R作为引物，和chCB3.1Lc作为模板扩增CB3.1VL0通过使用lgh631F和lgh640R作为引物，和ch8B5Hc作为模板扩增8B5VH。在引物lgh630R和lgh631F中并入接头序列。C末端接头和终止密码子被并入到lgh640R引物中。凝胶纯化PCR产物并以等摩尔比混合在一起，然后通过使用H9和lgh640R 作为引物扩增。然后用Ndel/EcoRI限制性核酸内切酶消化重叠PCR产物，并克隆到pCIneo载体中。
[0794]抗-Flag标签-8B5VL-CB3.1VH-VEPKSC
[0795]通过重叠PCR将抗-Flag标签插入到信号序列和8B5VL之间。通过使用H9和lgh647R作为引物和ch8B5Lc作为模板扩增信号序列和Flag标签。通过使用lgh647F和lgh629R 作为引物，和 8B5VL-CB3.1VH-VEPKSC 作为模板重新扩增 8B5VL-CB3.1VH-VEPKSC。凝胶纯化PCR产物并以等摩尔比混合在一起，然后通过使用H9和lgh629R作为引物扩增。然后用Ndel/EcoRI限制性核酸内切酶消化重叠PCR产物，并克隆到pCIneo载体中。
[0796]8B5VL-CB3.1VH-LGGC
[0797]为在8B5VL-CB3.1VH-VEPKSC构建体中产生不同的C末端接头，通过使用H9和lgh646R作为引物重新扩增该构建体。C末端LGGC接头被整合到lgh646R引物中。然后用Ndel/EcoRI限制性核酸内切酶消化PCR产物，并克隆到pCIneo载体中。
[0798]CB3.1VL-8B5VH-LGGC
[0799]同样的策略用来创建CB3.1VL-8B5VH-LGGC。C末端LGGC接头被整合到lgh648R引物中且CB3.1VL-8B5VH-FNRGEC被用作模板。然后用Ndel/EcoRI限制性核酸内切酶消化PCR产物，并克隆到pCIneo载体中。
[0800]抗-Flag标签-8B5VL-CB3.1VH-LGGC
[0801]同样的策略用来创建抗-Flag标签-8B5VL-CB3.1VH-LGGC。C末端LGGC接头被整合到lgh648R引物中且抗-Flag标签-8B5VL-CB3.1VH-VEPKSC被用作模板。然后用NdeI/EcoRI限制性核酸内切酶消化PCR产物，并克隆到pCIneo载体中。
[0802]8B5-CB3.1-VEPKSC 核苷酸序列(SEQ ID NO:230):
[0803]gacattcaga tgacacagtc tccatcctcc ctacttgcggcgctgggaga 50
[0804]aagagtcagt ctcacttgtc gggcaagtca ggaaattagtggttacttaa 100
[0805]gctggcttca gcagaaacca gatggaacta ttaaacgcctgatctacgcc 150
[0806]gcatccactt tagattctgg tgtcccaaaa aggttcagtggcagtgagtc 200
[0807]tgggtcagat tattctctca ccatcagcag tcttgagtctgaagattttg 250
[0808]cagactatta ctgtctacaa tattttagtt atccgctcacgttcggtgct 300
[0809]gggaccaagc tggagctgaa aggaggcgga tccggaggcggaggccaggt 350
[0810]ccaactgcag cagcctgggg ctgagctggt gaggcctggggcttcagtga 400
[0811]agctgtcctg caaggcttct ggctacacct tcaccagctactggatgaac 450
[0812]tgggtgaagc agaggcctgg acaaggcctt gaatggattggtatggttga 500
[0813]tccttcagac agtgaaactc actacaatca aatgttcaaggacaaggcca 550
[0814]cattgactgt tgacaaatcc tccagcacag cctacatgcagctcagcagc 600
[0815]ctgacatctg aggactctgc ggtctattac tgtgcaagagctatgggcta 650
[0816]ctggggtcaa ggaacctcag tcaccgtctc ctcagttgagcccaaatctt 700
[0817]gt702
[0818]8B5-CB3.1-VEPKSC 氨基酸序列(SEQ ID NO:231):
[0819]DIQMTQSPSS LLAALGERVS LTCRASQEIS GYLSWLQQKPDGTIKRLIYA 50
[0820]ASTLDSGVPK RFSGSESGSD YSLTISSLES EDFADYYCLQYFSYPLTFGA 100
[0821]GTKLELKGGG SGGGGQVQLQ QPGAELVRPG ASVKLSCKASGYTFTSYWMN 150
[0822]WVKQRPGQGL EWIGMVDPSD SETHYNQMFK DKATLTVDKSSSTAYMQLSS 200
[0823]LTSEDSAVYY CARAMGYWGQ GTSVTVSSVE PKSC234
[0824]CB3.1-8B5-FNRGEC 核苷酸序列(SEQ ID NO:232):
[0825]gatgttgtga tgacccagac tccactcact ttgtcggttaacattggaca 50
[0826]accagcctcc atctcttgta agtcaagtca gagcctcttagatactgatg 100
[0827]gaaagacata tttgaattgg ttgttacaga ggccaggccagtctccaaac 150
[0828]cgcctaatct atctggtgtc taaactggac tctggagtccctgacaggtt 200
[0829]cactggcagt ggatcaggga cagatttcac actgaaaatcagcagagtgg 250
[0830]aggctgagga tttgggaatt tattattgct ggcaaggtacacattttccg 300
[0831]ctcacgttcg gtgctgggac caagctggag ctgaaaggaggcggatccgg 350
[0832]aggcggaggc gaagtgaagc ttgaggagtc tggaggaggcttggtgcaac 400
[0833]ctggaggatc catgaaactc tcttgtgaag cctctggattcacttttagt 450
[0834]gacgcctgga tggactgggt ccgtcagtct ccagagaaggggcttgagtg 500
[0835]ggttgctgaa attagaaaca aagctaaaaa tcatgcaacatactatgctg 550[0836]agtctgtgat agggaggttc accatctcaa gagatgattc caaaagtagt 600
[0837]gtctacctgc aaatgaacag cttaagagct gaagacactg gcatttatta 650
[0838]ctgtggggct ctgggccttg actactgggg ccaaggcacc actctcacag 700
[0839]tctcctcgtt caacagggga gagtgt726
[0840]CB3.1-8B5-FNRGEC 氨基酸序列(SEQ ID NO:233):
[0841]DVVMTQTPLT LSVNIGQPAS ISCKSSQSLL DTDGKTYLNW LLQRPGQSPN 50
[0842]RLIYLVSKLD SGVPDRFTGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGI YYCffQGTHFP 100
[0843]LTFGAGTKLE LKGGGSGGGG EVKLEESGGG LVQPGGSMKL SCEASGFTFS 150
[0844]DAWMDffVRQS PEKGLEffVAE IRNKAKNHAT YYAESVIGRF TISRDDSKSS 200
[0845]VYLQMNSLRA EDTGIYYCGA LGLDYffGQGT TLTVSSFNRG EC242
[0846]8B5VL-CB3.1VH-LGGC
[0847]通过使用H9和gh694R作为引物，ch8B5Lc作为模板扩增8B5VL。通过使用lgh695F和lgh696R作为引物，ch8B5Hc作为模板扩增8B5VH。在引物lgh694R和lgh695F中并入接头序列。通过使用lgh355F和lgh366R作为引物，ch8B5Hc作为模板扩增HuIgGlFc。凝胶纯化PCR产物并以等摩尔比混合在一起，然后通过使用H9和lgh366R作为引物扩增。然后用Ndel/EcoRI限制性核酸内切酶消化重叠PCR产物，并克隆到pCIneo载体中。
[0848]8B5VL-CB3 .1VH-LGGC 核苷酸序列(SEQ ID NO:234):
[0849]gacattcaga tgacacagtc tccatcctcc ctacttgcgg cgctgggaga 50
[0850]aagagtcagt ctcacttgtc gggcaagtca ggaaattagt ggttacttaa 100
[0851]gctggcttca gcagaaacca gatggaacta ttaaacgcct gatctacgcc 150
[0852]gcatccactt tagattctgg tgtcccaaaa aggttcagtg gcagtgagtc 200
[0853]tgggtcagat tattctctca ccatcagcag tcttgagtct gaagattttg 250
[0854]cagactatta ctgtctacaa tattttagtt atccgctcac gttcggtgct 300
[0855]gggaccaagc tggagctgaa aggaggcgga tccggaggcg gaggccaggt 350
[0856]ccaactgcag cagcctgggg ctgagctggt gaggcctggg gcttcagtga 400
[0857]agctgtcctg caaggcttct ggctacacct tcaccagcta ctggatgaac 450
[0858]tgggtgaagc agaggcctgg acaaggcctt gaatggattg gtatggttga 500
[0859]tccttcagac agtgaaactc actacaatca aatgttcaag gacaaggcca 550
[0860]cattgactgt tgacaaatcc tccagcacag cctacatgca gctcagcagc 600
[0861]ctgacatctg aggactctgc ggtctattac tgtgcaagag ctatgggcta 650
[0862]ctggggtcaa ggaacctcag tcaccgtctc ctcactggga ggctgc696
[0863]8B5VL-CB3.1VH-LGGC 氨基酸序列(SEQ ID NO:235):
[0864]DIQMTQSPSS LLAALGERVS LTCRASQEIS GYLSWLQQKP DGTIKRLIYA 50
[0865]ASTLDSGVPK RFSGSESGSD YSLTISSLES EDFADYYCLQ YFSYPLTFGA 100
[0866]GTKLELKGGG SGGGGQVQLQ QPGAELVRPG ASVKLSCKAS GYTFTSYWMN 150
[0867]WVKQRPGQGL EWIGMVDPSD SETHYNQMFK DKATLTVDKS SSTAYMQLSS 200
[0868]LTSEDSAVYY CARAMGYWGQ GTSVTVSSLG GC232
[0869]CB3.1-8B5-LGGC 核苷酸序列(SEQ ID NO:236):
[0870]gatgttgtga tgacccagac tccactcact ttgtcggtta acattggaca 50[0871]accagcctcc atctcttgta agtcaagtca gagcctcttagatactgatg 100
[0872]gaaagacata tttgaattgg ttgttacaga ggccaggccagtctccaaac 150
[0873]cgcctaatct atctggtgtc taaactggac tctggagtccctgacaggtt 200
[0874]cactggcagt ggatcaggga cagatttcac actgaaaatcagcagagtgg 250
[0875]aggctgagga tttgggaatt tattattgct ggcaaggtacacattttccg 300
[0876]ctcacgttcg gtgctgggac caagctggag ctgaaaggaggcggatccgg 350
[0877]aggcggaggc gaagtgaagc ttgaggagtc tggaggaggcttggtgcaac 400
[0878]ctggaggatc catgaaactc tcttgtgaag cctctggattcacttttagt 450
[0879]gacgcctgga tggactgggt ccgtcagtct ccagagaaggggcttgagtg 500
[0880]ggttgctgaa attagaaaca aagctaaaaa tcatgcaacatactatgctg 550
[0881]agtctgtgat agggaggttc accatctcaa gagatgattccaaaagtagt 600
[0882]gtctacctgc aaatgaacag cttaagagct gaagacactggcatttatta 650
[0883]ctgtggggct ctgggccttg actactgggg ccaaggcaccactctcacag 700
[0884]tctcctcgct gggaggctgc720`[0885]CB3.1-8B5-LGGC 氨基酸序列(SEQ ID NO:237):
[0886]DVVMTQTPLT LSVNIGQPAS ISCKSSQSLL DTDGKTYLNWLLQRPGQSPN 50
[0887]RLIYLVSKLD SGVPDRFTGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGIYYCWQGTHFP 100
[0888]LTFGAGTKLE LKGGGSGGGG EVKLEESGGG LVQPGGSMKLSCEASGFTFS 150
[0889]DAWMDWVRQS PEKGLEWVAE IRNKAKNHAT YYAESVIGRFTISRDDSKSS 200
[0890]VYLQMNSLRA EDTGIYYCGA LGLDYWGQGT TLTVSSLGGC240
[0891]引物:
[0892]Lgh628F(SEQ ID NO:238):
[0893]ggaggcggat ccggaggcgg aggccaggtc caactgcagc`agcctgg 47
[0894]Lgh629R(SEQ ID NO:239):
[0895]tttgaattct aacaagattt gggctcaact gaggagacggtgactgagg 49
[0896]Lgh630R(SEQ ID NO:240):
[0897]gcctccgcct ccggatccgc ctcctttcag ctccagcttggtccc45
[0898]Lgh631F(SEQ ID NO:241):
[0899]ggaggcggat ccggaggcgg aggcgaagtg aagcttgaggagtctgg 47
[0900]Lgh640R(SEQ ID NO:242):
[0901]tttgaattct aacactctcc cctgttgaac gaggagactgtgagagtgg 49
[0902]Lgh644R(SEQ ID NO:243):
[0903]tttgtcgtca tcatcgtctt tgtagtcgga gtggacacctgtggagag 48
[0904]Lgh646R(SEQ ID NO:244):
[0905]tttgaattct agcagcctcc cagtgaggag acggtgactgag42
[0906]Lgh647F(SEQ ID NO:245):
[0907]caaagacgat gatgacgaca aagacattca gatgacacagtctcc45
[0908]Lgh648R(SEQ ID NO:246):
[0909]tttgaattct agcagcctcc cagcgaggag actgtgagagtgg43[0910]表达:使用Lipofectamine2000 (Invitrogen)将编码构建体 5 和 6,或 6 和 7,或 8和9，或9和10的表达质粒(图30)共转染到HEK-293细胞中以表达含有或不含抗flag标签的8B5-CB3.1DART。每三天收集条件培养基，持续三次。然后使用⑶32B亲和柱纯化条件培养基。
[0911]ELISA:如下进行ELISA:在碳酸盐缓冲液中，在4°C下将50 y I/孔的g/ml的CD32B-Fc过夜包被在96-孔Maxisorp板上。在加入受试单链Fe融合蛋白前，用PBS-T (PBS,0.1%吐温20)洗涤平板三次并然后在室温下通过PBS-T中的0.5% BSA封闭30分钟。封闭期间，将8B5-CB3.1DART稀释为从2 u g/ml开始的2倍系列稀释液。将与25 U I/孔的50ng/ml ch8B5混合的25 μl/孔的稀释的DART从稀释平板转移到ELISA平板。室温下孵育平板I小时。用PBS-T洗涤三次后，将50 μl/孔的1: 10，000稀释的HRP偶联的F(ab')2山羊抗人IgG F (ab’)2 (Jackson ImmunoResearch)加至平板。室温下孵育平板1小时。用PBS-T洗涤平板三次并用80 u l/孔的TMB底物显色。孵育5分钟后，通过40 μ l/孔的1 %H2SO4终止反应。使用96-孔读板机和SOFTmax软件读取0D450。使用GraphPadPri sm3.03软件对读出值作图(图31)。
[0912]6.10 Ig样四价DART的设计和表征
[0913]使用4条多肽链来制备具有四价抗原结合位点的Ig-样DART物质(图32 ;图33)。Ig样DART物质具有独特的性质，因为其结构域可被设计为结合相同表位(以形成能够结合4个相同抗原分子的四价、单表位特异性的Ig样DART)，或结合不同的表位或抗原。例如，其结构域可被设计成结合同一抗原的两个表位(以形成四价、单抗原特异性、双表位特异性的Ig样DART)，或结合不同抗原分子的表位以形成具有对第一抗原特异性的一对结合位点和对第二个抗原特异性的第二对结合位点的四价Ig样DART。可容易地产生具有这些属性的组合的杂交分子。
[0914]为展示该Ig样DART物质的特征，制备了具有对CD32特异性的一对结合位点和对CD16A特异性的第二对结合位点的示例性四价Ig样DART物质。使用下述4条多肽链来制备该Ig样DART物质:
[0915]2.4G2-3G8-h k 核苷酸序列(SEQ ID NO:247):
[0916]gatgtccaga tgacccagtc tccatctaat cttgctgcct ctcctggaga 50
[0917]aagtgtttcc atcaattgca aggcaagtga gagcattagc aagtatttag 100
[0918]cctggtatct acagaaacct gggaaagcaa ataagcttct tatgtacgat 150
[0919]gggtcaactt tgcaatctgg aattccatcg aggttcagtg gcagtggatc 200
[0920]tggtacagat ttcactctca ccatcagaag cctggagcct gaagattttg 250
[0921]gactctatta ctgtcaacag cattatgaat atccagccac gttcggttct 300
[0922]gggaccaagc tggagatcaa aggaggcgga tccggaggcg gaggccaggt 350
[0923]taccctgaaa gagtctggcc ctgggatatt gcagccctcc cagaccctca 400
[0924]gtctgacttg ttctttctct gggttttcac tgaggacttc tggtatgggt 450
[0925]gtaggctgga ttcgtcagcc ttcagggaag ggtctagagt ggctggcaca 500
[0926]catttggtgg gatgatgaca agcgctataa tccagccctg aagagccgac 550
[0927]tgacaatctc caaggatacc tccagcaacc aggtattcct caaaatcgcc 600
[0928]agtgtggaca ctgcagatac tgccacatac tactgtgctc aaataaaccc 650
[0994]具有上述序列的Ig样DART分子的制剂从不同质粒分离物获得并命名为“IgDART1”和“Ig DART2”。将ELISA中这些Ig样DART物质结合mCD32_hCD16A的能力与单独的培养基、具有单一 CD32结合位点和单一 CD16A结合位点的DART( “DART”)及对照抗-ch-mCD32mAb的能力进行比较(图34)。发现本发明的Ig样DART具有比任一种DART或对照抗体高得多的抗原结合亲和力。
[0995]6.11 CD32B-CD79-1和CD32B-CD79-2双特异性双抗体的设计和表征
[0996]编码CD79VL-CD32BVH (序列 I)、CD32BVL-CD79VH-1 (序列 2)和⑶32BVL-⑶79VH-2 (序列3)的基因被克隆到表达载体pEE13中，分别产生表达构建体1，2，和3。将构建体I表达质粒与表达质粒2或3 —起共转染到HEK-293细胞中以分别制备⑶32B-⑶79-1和⑶32B-⑶79-2双特异性双抗体。每三天收集条件培养基，持续三次。然后使用⑶32B亲和柱纯化条件培养基。
[0997]在碳酸盐缓冲液中，在4°C下将50iU/孔的2 ii g/ml的⑶32B_Fc过夜包被在96-孔Maxi sorp板上。在加入受试单链Fe融合蛋白前，用PBS-T (PBS，0.1 %吐温20)洗涤平板三次并然后在室温下通过PBS-T中的0.5% BSA封闭30分钟。封闭期间，将⑶32B-⑶79-1或⑶32B-⑶79-2双特异性双抗体稀释为从2 u g/ml开始的2倍系列稀释液。将25 U I/孔的稀释的双特异性双抗体与25 u I/孔的50ng/ml抗-⑶32B抗体混合并加至ELISA平板。室温下孵育平板I小时。用PBS-T洗涤三次后，将50 u I/孔的1:10，000稀释的HRP偶联的F (ab，)2山羊抗人IgG F (ab，)2 (Jackson ImmunoResearch)加至平板。室温下孵育平板I小时。用PBS-T洗涤平板三次并用80iil/孔的TMB底物显色。孵育5分钟后，通过40 Ul/孔的I % H2SO4终止反应。使用96-孔读板机和SOFTmax软件读取0D450nm。使用GraphPadPrism3.03软件对读出值作图。实验揭示CD32B-CD79-1和CD32B-CD79-2双特异性双抗体能够以与抗CD32B对照抗体的亲和力相等的亲和力免疫特异性地结合CD32-Fc。上述构建体的核苷酸序列和所编码的氨基酸序列如下:
[0998]序列1-CD79VL-CD32BVH 核苷酸序列(SEQ ID NO:251):
[0999]gatgttgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccttggaca 50
[1000]gccggcctcc atctcctgca agtcaagtca gagcctctta gatagtgatg 100
[1001]gaaagacata tttgaattgg tttcagcaga ggccaggcca atctccaaac 150
[1002]cgcctaattt atctggtgtc taaactggac tctggggtcc cagacagatt 200
[1003]cagcggcagt gggtcaggca ctgatttcac actgaaaatc agcagggtgg 250
[1004]aggctgagga tgttggggtt tattactgct ggcaaggtac acattttccg 300
[1005]ctcacgttcg gcggagggac caagcttgag atcaaaggag gcggatccgg 350
[1006]aggcggaggc gaagtgaagc ttgaggagtc tggaggaggc ttggtgcaac 400 [1007]ctggaggatc catgaaactc tcttgtgaag cctctggatt cacttttagt 450
[1008]gacgcctgga tggactgggt ccgtcagtct ccagagaagg ggcttgagtg 500
[1009]ggttgctgaa attagaaaca aagctaaaaa tcatgcaaca tactatgctg 550
[1010]agtctgtgat agggaggttc accatctcaa gagatgattc caaaagtagt 600
[1011]gtctacctgc aaatgaacag cttaagagct gaagacactg gcatttatta 650
[1012]ctgtggggct ctgggccttg actactgggg ccaaggcacc actctcacag 700
[1013]tctcctcgct gggaggctgc720
[1014]序列2-CD79VL-CD32BVH 氨基酸序列(SEQ ID NO:252):
[1015]DVVMTQSPLS LPVTLGQPAS ISCKSSQSLL DSDGKTYLNW FQQRPGQSPN 50
[1016]RLIYLVSKLD SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCWQGTHFP 100
[1017]LTFGGGTKLE IKGGGSGGGG EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS 150
[1018]DAWMDffVRQA PGKGLEffVAE IRNKAKNHAT YYAESVIGRF TISRDDAKNS 200
[1019]LYLQMNSLRA EDTAVYYCGA LGLDYWGQGT LVTVSSLGGC240
[1020]序列3-CD32BVL-CD79VH-1 核苷酸序列(SEQ ID NO:253):
[1021]gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ttatctgcct ctgtgggaga 50
[1022]tagagtcacc atcacttgtc gggcaagtca ggaaattagt ggttacttaa 100
[1023]gctggctgca gcagaaacca ggcaaggccc ctagacgcct gatctacgcc 150
[1024]gcatccactt tagattctgg tgtcccatcc aggttcagtg gcagtgagtc 200
[1025]tgggaccgag ttcaccctca ccatcagcag ccttcagcct gaagattttg 250
[1026]caacctatta ctgtctacaa tattttagtt atccgctcac gttcggaggg 300[1027]gggaccaagg tggaaataaa aggaggcgga tccggaggcg gaggccaggt 350
[1028]tcagctggtg cagtctggag ctgaggtgaa gaagcctggc gcctcagtga 400
[1029]aggtctcctg caaggcttct ggttacacctttaccagcta ctggatgaac 450
[1030]tgggtgcgac aggcccctgg acaagggcttgagtggatcg gaatgattga 500
[1031]tccttcagac agtgaaactc actacaatca aatgttcaag gacagagtca 550
[1032]ccatgaccac agacacatcc acgagcacag cctacatgga gctgaggagc 600
[1033]ctgagatctg acgacacggc cgtgtattactgtgcgagag ctatgggcta 650
[1034]ctgggggcaa gggaccacgg tcaccgtctcctcactggga ggctgc696
[1035]序列4-CD32BVL-CD79VH-1 氨基酸序列(SEQ ID NO:254):
[1036]DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQEISGYLSWLQQKP GKAPRRLIYA 50
[1037]ASTLDSGVPS RFSGSESGTE FTLTISSLQPEDFATYYCLQ YFSYPLTFGG 100
[1038]GTKVEIKGGG SGGGGQVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYTFTSYWMN 150
[1039]WVRQAPGQGL EWIGMIDPSD SETHYNQMFK DRVTMTTDTS TSTAYMELRS 200 [1040]LRSDDTAVYY CARAMGYWGQ GTTVTVSSLG GC232
[1041]序列5-CD32BVL-CD79VH-2 核苷酸序列(SEQ ID NO:255):
[1042]gacatccaga tgacccagtc tccatcctccttatctgcct ctgtgggaga 50
[1043]tagagtcacc atcacttgtc gggcaagtca ggaaattagt ggttacttaa 100
[1044]gctggctgca gcagaaacca ggcaaggcccctagacgcct gatctacgcc 150
[1045]gcatccactt tagattctgg tgtcccatccaggttcagtg gcagtgagtc 200
[1046]tgggaccgag ttcaccctca ccatcagcag ccttcagcct gaagattttg 250
[1047]caacctatta ctgtctacaa tattttagttatccgctcac gttcggaggg 300
[1048]gggaccaagg tggaaataaa aggaggcgga tccggaggcg gaggccaggt 350
[1049]tcagctggtg cagtctggag ctgaggtgaa gaagcctggc gcctcagtga 400
[1050]aggtctcctg caaggcttct ggttacacctttaccagcta ctggatgaac 450
[1051]tgggtgcgac aggcccctgg acaagggcttgagtggatcg gaatgattga 500
[1052]tccttcagac agtgaaactc actacaatca aaagttcaag gacagagtca 550
[1053]ccatgaccac agacacatcc acgagcacag cctacatgga gctgaggagc 600
[1054]ctgagatctg acgacacggc cgtgtattactgtgcgagag ctatgggcta 650
[1055]ctgggggcaa gggaccacgg tcaccgtctcctcactggga ggctgc696
[1056]序列6-CD32BVL-CD79VH-2 氨基酸序列(SEQ ID NO:256):
[1057]DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQEISGYLSWLQQKP GKAPRRLIYA 50
[1058]ASTLDSGVPS RFSGSESGTE FTLTISSLQPEDFATYYCLQ YFSYPLTFGG 100
[1059]GTKVEIKGGG SGGGGQVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYTFTSYWMN 150
[1060]WVRQAPGQGL EWIGMIDPSD SETHYNQKFK DRVTMTTDTS TSTAYMELRS 200
[1061]LRSDDTAVYY CARAMGYWGQ GTTVTVSSLG GC232
[1062]6.12 H8B5-HBCRC生物功能性双抗体的构建和优化
[1063]构建了包含能够结合⑶32和B细胞受体复合体(“BCRC”)的可变区的双抗体。
[1064]克隆.使用标准PCR/重叠PCR构建构建体:
[1065]h8B5VL-G3SG4-hBCRCVH M481-LGGC:[1066]通过使用lgh321F和lgh788R作为引物扩增完全人源化的8B5VL(，识别CD32)。通过使用lgh784F和lgh386R作为引物扩增hBCRCVH M48I。凝胶纯化PCR产物并混合在一起，并然后通过使用lgh321F和lgh386R扩增。然后将重叠PCR片段在Xba1-EcoRI位点处克隆到PEE6中。“G3SG4”是具有序列:GGGSGGGG(SEQ ID NO:10)的接头。
[1067]hBCRCVL R45N_G3SG4-h8B5VH_LGGC
[1068]通过使用lgh321F和lgh785R作为引物扩增hBCRCVL R45N。通过使用lgh787F和lgh786R作为引物扩增h8B5VH。凝胶纯化PCR产物并混合在一起，并然后通过使用引物lgh321F和lgh786R扩增。然后将重叠PCR片段在Xba1-EcoRI位点处克隆到pEE13中。
[1069]单一载体的构建。pEE6hHBCRCVL R45N-h8B5VH在Bgl I1-Sal I位点处被消化，并纯化 3.3kb 片段并在 BamH1-SalI 位点处插入到 pEE13hHBCRCVL45N_h8B5VH 中。Bgl II 和BamH I共有相容性的粘性末端。以下描绘了 DART和用于构建DART的引物的序列:
[1070]hHBCRCVL.R45N-h8B5VH-LGGC 核苷酸序列(SEQ ID NO:257):
[1071]gatgttgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccttggaca 50
[1072]gccggcctcc atctcctgca agtcaagtca gagcctctta gatagtgatg 100
[1073]gaaagacata tttgaattgg tttcagcaga ggccaggcca atctccaaac 150
[1074]cgcctaattt atctggtgtc taaactggac tctggggtcc cagacagatt 200 [1075]cagcggcagt gggtcaggca ctgatttcac actgaaaatc agcagggtgg 250
[1076]aggctgagga tgttggggtt tattactgct ggcaaggtac acattttccg 300
[1077]ctcacgttcg gcggagggac caagcttgag atcaaaggag gcggatccgg 350
[1078]aggcggaggc gaagtgaagc ttgaggagtc tggaggaggc ttggtgcaac 400
[1079]ctggaggatc catgaaactc tcttgtgaag cctctggatt cacttttagt 450
[1080]gacgcctgga tggactgggt ccgtcagtct ccagagaagg ggcttgagtg 500
[1081]ggttgctgaa attagaaaca aagctaaaaa tcatgcaaca tactatgctg 550
[1082]agtctgtgat agggaggttc accatctcaa gagatgattc caaaagtagt 600
[1083]gtctacctgc aaatgaacag cttaagagct gaagacactg gcatttatta 650
[1084]ctgtggggct ctgggccttg actactgggg ccaaggcacc actctcacag 700
[1085]tctcctcgct gggaggctgc720
[1086]hHBCRCVL.R45N-h8B5VH-LGGC 氨基酸序列(SEQ ID NO:258):
[1087]DVVMTQSPLS LPVTLGQPAS ISCKSSQSLL DSDGKTYLNW FQQRPGQSPN 50
[1088]RLIYLVSKLD SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCWQGTHFP 100
[1089]LTFGGGTKLE IKGGGSGGGG EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS 150
[1090]DAWMDWVRQA PGKGLEWVAE IRNKAKNHAT YYAESVIGRF TISRDDAKNS 200
[1091]LYLOMNSLRA EDTAVYYCGA LGLDYWGQGT LVTVSSLGGC240
[1092]H8B5VL-hHBCRCVH M481-LGGC 核苷 酸序列(SEQ ID NO:259):
[1093]gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ttatctgcct ctgtgggaga 50
[1094]tagagtcacc atcacttgtc gggcaagtca ggaaattagt ggttacttaa 100
[1095]gctggctgca gcagaaacca ggcaaggccc ctagacgcct gatctacgcc 150
[1096]gcatccactt tagattctgg tgtcccatcc aggttcagtg gcagtgagtc 200
[1097]tgggaccgag ttcaccctca ccatcagcag ccttcagcct gaagattttg 250[1098]caacctatta ctgtctacaa tattttagtt atccgctcac gttcggaggg 300
[1099]gggaccaagg tggaaataaa aggaggcgga tccggaggcg gaggccaggt 350
[1100]tcagctggtg cagtctggag ctgaggtgaa gaagcctggc gcctcagtga 400
[1101]aggtctcctg caaggcttct ggttacacct ttaccagcta ctggatgaac 450
[1102]tgggtgcgac aggcccctgg acaagggctt gagtggatcg gaatgattga 500
[1103]tccttcagac agtgaaactc actacaatca aatgttcaag gacagagtca 550
[1104]ccatgaccac agacacatcc acgagcacag cctacatgga gctgaggagc 600
[1105]ctgagatctg acgacacggc cgtgtattac tgtgcgagag ctatgggcta 650
[1106]ctgggggcaa gggaccacgg tcaccgtctc ctcactggga ggctgc 696
[1107]H8B5VL-HBCRCVH M481-LGGC 氨基酸序列(SEQ ID NO:260):
[1108]DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQEIS GYLSWLQQKP GKAPRRLIYA 50
[1109]ASTLDSGVPS RFSGSESGTE FTLTISSLQP EDFATYYCLQ YFSYPLTFGG 100
[1110]GTKVEIKGGG SGGGGQVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYTFTSYWMN 150
[1111]WVRQAPGQGL EWIGMIDPSD SETHYNQMFK DRVTMTTDTS TSTAYMELRS 200 [1112]LRSDDTAVYY CARAMGYWGQ GTTVTVSSLG GC232
[1113]Lgh321F 引物(SEQ ID NO:261):
[1114]cgagctagct ctagatgaga tcacagttct ctctac 36Lgh386R引物(SEQ ID NO:262):
[1115]tttgaattct agcagcctcc cagtgaggag acggtgaccg tggtc45
[1116]Lgh784F 引物(SEQ ID NO:263):
[1117]ggcggatccg gaggcggagg ccaggttcag ctggtgcag39
[1118]Lgh785R 引物(SEQ ID NO:264):
[1119]cctccggatc cgcctccttt gatctcaagc ttggtccc38
[1120]Lgh786R 引物(SEQ ID NO:265):
[1121]tttgaattct agcagcctcc caggctggag acggtcacca gg42
[1122]Lgh787F 引物(SEQ ID NO:266):
[1123]ggaggcggat ccggaggcgg aggcgaagtg cagcttgtgg agtc44
[1124]将Hu3G8VLl-G3SG4-Hu2B6VH4-LGGC 表达质粒与 Hu2B6VL5-G3SG4-Hu3G8VH5_LGGC一起共转染到HEK-293细胞中以制备识别CD32和CD79的Hu2B64.5_Hu3G85.1双特异性双抗体。同时，将 Hu2B6VL5-G3SG4-Hu2B6VH4-LGGC 和 Hu3G8VLl-G3SG4-Hu3G8VH5_LGGC 单独地转染到HEK-293细胞中以制备Hu2B6 4.5和Hu3G8 5.1双抗体。培养三天后，收集条件培养基并通过结合ELISA表征。图36中描绘了该实验的结果。
[1125]实验设计:在碳酸盐缓冲液中，在40°C下将IOOng/孔的可溶性FcRIIb-G2_Agly过夜包被在96-孔Maxisorp板上。在加入双抗体前，用PBS/0.1 %吐温20洗涤平板三次并在室温下通过PBS/0.1%吐温20中的0.5% BSA封闭30分钟。从25ng/孔开始的Hu2B64.5-Hu3G8 5.1双特异性双抗体、Hu2B6 4.5双抗体和hu3G8 5.1双抗体的一系列两倍稀释液被加至每个孔。室温孵育平板I小时。用PBS/0.1 %吐温20洗涤三次后，将IOng/孔的FcRIIIa-G2-生物素加至平板。室温孵育平板I小时。用PBS/0.1%吐温洗涤三次后，使用50ul的1: 5000稀释的HRP偶联的链霉亲和素(Amersham Pharmacia Biotech)检测。室温孵育45分钟后，用PBS/0.1 %吐温洗涤平板三次并使用TMB底物显色。孵育10分钟后，通过I % H2SO4终止反应。通过SOFTmax程序读取0D450nm。使用GraphPadPrism3.03软件对读出值作图。
[1126]6.13 IgDART双抗体的构建
[1127]构建了包含能够结合⑶32和B细胞受体复合体(“BCRC”)的可变区的IgDART双抗体。第一双抗体在分子的VH序列和Fe序列之间釆用LGGCGGGS (SEQ ID NO:267)接头。第二双抗体釆用具有序列LEIK (SEQ ID NO:268)的LEIK接头或具有序列TVSS (SEQ ID NO:269)的TVSS接头。以下展示了这些双抗体的链的序列和编码多核苷酸:
[1128]H8B5VL-hBCRCVH M48I，M62K—LGGCG3S—h k (SEQ ID NO:270):
[1129]DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQEIS GYLSWLQQKP GKAPRRLIYA 50
[1130]ASTLDSGVPS RFSGSESGTE FTLTISSLQP EDFATYYCLQ YFSYPLTFGG 100
[1131]GTKVEIKGGG SGGGGQVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYTFTSYWMN 150
[1132]WVRQAPGQGL EWIGMIDPSD SETHYNQKFK DRVTMTTDTS TSTAYMELRS 200
[1133]LRSDDTAVYY CARAMGYWGQ GTTVTVSSLG GCGGGSRTVA APSVFIFPPS 250
[1134]DEQLKSGTAS VVCLLNNFYP REAKVQWKVD NALQSGNSQE SVTEQDSKDS 300
[1135]TYSLSSTLTL SKADYEKHKV YACEVTHQGL SSPVTKSFNR GEC343
[1136]通过位于位置108-115处的接头GGGSGGGG (SEQ ID NO: 10)，H8B5VL序列被融合到 hBCRCVH序列。通过位于位置 229-236 处的接头 LGGCGGGS (SEQ ID NO:267) ,hBCRCVH 序列被融合到Fe序列(两种接头显示为以上的`下划线部分)。编码H8B5VL-hBCRCVH M481、M62K—LGGCG3S—h K序列的多核苷酸是:
[1137](SEQ ID NO:271):
[1138]gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ttatctgcct ctgtgggaga 50
[1139]tagagtcacc atcacttgtc gggcaagtca ggaaattagt ggttacttaa 100
[1140]gctggctgca gcagaaacca ggcaaggccc ctagacgcct gatctacgcc 150
[1141]gcatccactt tagattctgg tgtcccatcc aggttcagtg gcagtgagtc 200
[1142]tgggaccgag ttcaccctca ccatcagcag ccttcagcct gaagattttg 250
[1143]caacctatta ctgtctacaa tattttagtt atccgctcac gttcggaggg 300
[1144]gggaccaagg tggaaataaa aggaggcgga tccggaggcg gaggccaggt 350
[1145]tcagctggtg cagtctggag ctgaggtgaa gaagcctggc gcctcagtga 400
[1146]aggtctcctg caaggcttct ggttacacct ttaccagcta ctggatgaac 450
[1147]tgggtgcgac aggcccctgg acaagggctt gagtggatcg gaatgattga 500
[1148]tccttcagac agtgaaactc actacaatca aaagttcaag gacagagtca 550
[1149]ccatgaccac agacacatcc acgagcacag cctacatgga gctgaggagc 600
[1150]ctgagatctg acgacacggc cgtgtattac tgtgcgagag ctatgggcta 650
[1151]ctgggggcaa gggaccacgg tcaccgtctc ctcactggga ggctgcggcg 700
[1152]Ragggagccg aactgtggct gcaccatcgg tcttcatctt cccgccatct 750
[1153]gatgagcagt tgaaatctgg aactgcctct gttgtgtgcc tgctgaataa 800
[1154]cttctatccc agagaggcca aagtacagtg gaaggtggat aacgccctcc 850
[1155]aatcgggtaa ctcccaggag agtgtcacag agcaggacag caaggacagc 900
[1156]acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg agcaaagcag actacgagaa 1000[1157]acacaaagtc tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg agctcgcccg 1050
[1158]tcacaaagag cttcaacagg ggagagtgtt ag1082
[1159]其中编码接头:GGGSGGGG(SEQID NO:10)和 LGGCGGGS (SEQ ID NO:267)的序列分别位于位置322-345和685-708处(两种接头显示为以上的下划线部分)。
[1160]HBCRCVL R45N_h8B5VH_LGGCGGGS_hGl(SEQ ID NO:272):
[1161]DVVMTQSPLS LPVTLGQPAS ISCKSSQSLL DSDGKTYLNW FQQRPGQSPN 50
[1162]RLIYLVSKLD SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCWQGTHFP 100 [1163]LTFGGGTKLE IKGGGSGGGG EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS 150
[1164]DAWMDWVRQA PGKGLEWVAE IRNKAKNHAT YYAESVIGRF TISRDDAKNS 200
[1165]LYLQMNSLRA EDTAVYYCGA LGLDYWGQGT LVTVSSLGGC GGGSASTKGP 250
[1166]SVFPLAPSSK STSGGTAALG CLVKDYFPEP VTVSffNSGAL TSGVHTFPAV 300
[1167]LQSSGLYSLS SVVTVPSSSL GTQTYICNVN HKPSNTKVDK RVEPKSCDKT 350
[1168]HTCPPCPAPE LLGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSHEDPEV 400
[1169]KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRVV SVLTVLHQDff LNGKEYKCKV 450
[1170]SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP SRDELTKNQV SLTCLVKGFY 500
[1171]PSDIAVEffES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD KSRffQQGNVF 550
[1172]SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK574
[1173]通过位于位置113-120处的接头GGGSGGGG (SEQ ID NO:10)，hBCRCVL序列被融合到H8B5VH序列。通过位于位置237-244处的接头LGGCGGGS (SEQ ID NO:267)，H8B5VH序列被融合到Fe序列(两种接头显示为以上的下划线部分)。编码HBCRCVL R45N-h8B5VH_LGGCGGGS-hGl序列的多核苷酸是:
[1174](SEQ ID NO:273):
[1175]gatgttgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccttggaca 50
[1176]gccggcctcc atctcctgca agtcaagtca gagcctctta gatagtgatg 100
[1177]gaaagacata tttgaattgg tttcagcaga ggccaggcca atctccaaac 150
[1178]cgcctaattt atctggtgtc taaactggac tctggggtcc cagacagatt 200
[1179]cagcggcagt gggtcaggca ctgatttcac actgaaaatc agcagggtgg 250
[1180]aggctgagga tgttggggtt tattactgct ggcaaggtac acattttccg 300
[1181]ctcacgttcg gcggagggac caagcttgag atcaaaggag gcggatccgg 350
[1182]aggcggaggc gaagtgcagc ttgtggagtc tggaggaggc ttggtgcaac 400
[1183]ctggaggatc cctgagactc tcttgtgccg cctctggatt cacttttagt 450
[1184]gacgcctgga tggactgggt ccgtcaggcc ccaggcaagg ggcttgagtg 500
[1185]ggttgctgaa attagaaaca aagctaaaaa tcatgcaaca tactatgctg 550
[1186]agtctgtgat agggaggttc accatctcaa gagatgacgc caaaaacagt 600
[1187]ctgtacctgc aaatgaacag cttaagagct gaagacactg ccgtgtatta 650
[1188]ctgtggggct ctgggccttg actactgggg ccaaggcacc ctggtgaccg 700
[1189]tctccagcct gggaggctgc ggcggaggga gcgcctccac caagggccca 750
[1190]tcggtcttcc ccctggcacc ctcctccaag agcacctctg ggggcacagc 800
[1191]ggccctgggc tgcctggtca aggactactt ccccgaaccg gtgacggtgt 850[1192]cgtggaactc aggcgccctg accagcggcg tgcacacctt cccggctgtc 900
[1193]ctacagtcct caggactcta ctccctcagc agcgtggtga ccgtgccctc 950
[1194]cagcagcttg ggcacccaga cctacatctg caacgtgaat cacaagccca 1000
[1195]gcaacaccaa ggtggacaag agagttgagc ccaaatcttg tgacaaaact 1050
[1196]cacacatgcc caccgtgccc agcacctgaa ctcctggggg gaccgtcagt 1100
[1197]cttcctcttc cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc tcccggaccc 1150
[1198]ctgaggtcac atgcgtggtg gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc 1200
[1199]aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag gtgcataatg ccaagacaaa 1250
[1200]gccgcgggag gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc agcgtcctca 1300 [1201]ccgtcctgca ccaggactgg ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc 1350
[1202]tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa 1400
[1203]agggcagccc cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca tcccgggatg 1450
[1204]agctgaccaa gaaccaggtc agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat 1500
[1205]cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc aatgggcagc cggagaacaa 1550
[1206]ctacaagacc acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc ttcttcctct 1600
[1207]acagcaagct caccgtggac aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc 1650
[1208]tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cgcagaagag 1700
[1209]cctctccctg tctccgggta aa1722
[1210]其中编码接头:GGGSGGGG(SEQID NO:10)和LGGCGGGS (SEQ ID NO:267)的序列分别位于位置337-360和709-732处(两种接头显示为以上的下划线部分)。
[1211]H8B5VL-HBCRCVH M48I, M62K_(-4)LEIK_hk (SEQ ID NO:274):
[1212]DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQEIS GYLSWLQQKP GKAPRRLIYA 50
[1213]ASTLDSGVPS RFSGSESGTE FTLTISSLQP EDFATYYCLQ YFSYPLTFGG 100
[1214]GTKVEIKGGG SGGGGQVQLV QSGAFVKKPG ASVKVSCKAS GYTFTSYWMN 150
[1215]WVRQAPGQGL EWIGMIDPSD SETHYNQKFK DRVTMTTDTS TSTAYMELRS 200
[1216]LRSDDTAVYY CARAMGYWGQ GTTVLEIKRT VAAPSVFIFP PSDEQLKSGT 250
[1217]ASVVCLLNNF YPREAKVQffK VDNALQSGNS QESVTEQDSK DSTYSLSSTL 300
[1218]TLSKADYEKH KVYACEVTHQ GLSSPVTKSF NRGEC335
[1219]通过位于位置108-115处的接头GGGSGGGG (SEQ ID NO:10)，H8B5VL序列被融合到HBCRCVH序列。通过位于位置225-228处的接头LEIK (SEQ ID NO:268)，HBCRCVH序列被融合到Fe序列(两种接头显示为以上的下划线部分)。编码H8B5VL-HBCRCVH M481、M62K_(-4) LEIK_h K序列的多核苷酸是:
[1220](SEQ ID NO:275):
[1221]gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ttatctgcct ctgtgggaga 50
[1222]tagagtcacc atcacttgtc gggcaagtca ggaaattagt ggttacttaa 100
[1223]gctggctgca gcagaaacca ggcaaggccc ctagacgcct gatctacgcc 150
[1224]gcatccactt tagattctgg tgtcccatcc aggttcagtg gcagtgagtc 200
[1225]tgggaccgag ttcaccctca ccatcagcag ccttcagcct gaagattttg 250
[1226]caacctatta ctgtctacaa tattttagtt atccgctcac gttcggaggg 300[1227]gggaccaagg tggaaataaa aggaggcgga tccggaggcggaggccaggt 350
[1228]tcagctggtg cagtctggag ctgaggtgaa gaagcctggcgcctcagtga 400
[1229]aggtctcctg caaggcttct ggttacacct ttaccagctactggatgaac 450
[1230]tgggtgcgac aggcccctgg acaagggctt gagtggatcggaatgattga 500
[1231]tccttcagac agtgaaactc actacaatca aaagttcaaggacagagtca 550
[1232]ccatgaccac agacacatcc acgagcacag cctacatggagctgaggagc 600
[1233]ctgagatctg acgacacggc cgtgtattac tgtgcgagagctatgggcta 650
[1234]ctgggggcaa gggaccacgg tcctggagat caagcgaactgtggctgcac 700
[1235]catcggtctt catcttcccg ccatctgatg agcagttgaaatctggaact 750
[1236]gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc tatcccagagaggccaaagt 800
[1237]acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcccaggagagtg 850
[1238]tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcagcagcaccctg 900
[1239]acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacgcctgcgaagt 950
[1240]cacccatcag ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttcaacaggggag 1000
[1241]agtgt1005
[1242]其中编码接头:GGGSGGGG(SEQ ID NO:10)和 LEIK (SEQ ID NO:268)的序列分别位于322-345和673-684(两种接头显示为以上的下划线部分)。
[1243]HBCRCVL R45N_h8B5VH_(_4)TVSS-hGl = HBCRCVL R45N_h8B5VH__hGl
[1244](SEQ ID NO:276):
[1245]DVVMTQSPLS LPVTLGQPAS ISCKSSQSLL DSDGKTYLNW FQQRPGQSPN 50
[1246]RLIYLVSKLD SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGVYYCWQGTHFP 100
[1247]LTFGGGTKLE IKGGGSGGGG EVQLVESGGG LVQPGGSIRLSCAASGFTFS 150
[1248]DAWMDWVRQA PGKGLEWVAE IRNKAKNHAT YYAESVIGRFTISRDDAKNS 200
[1249]LYLQMNSLRA EDTAVYYCGA LGLDYWGQGT LVTVSSASTKGPSVFPLAPS 250
[1250]SKSTSGGTAA LGCLVKDYFP EPVTVSffNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYS 300
[1251]LSSVVTVPSS SLGTQTYICN VNHKPSNTKV DKRVEPKSCDKTHTCPPCPA 350
[1252]PELLGGPSVF LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VVVDVSHEDPEVKFNWYVDG 400
[1253]VEVHNAKTKP REEQYNSTYR VVSVLTVLHQ DffLNGKEYKCKVSNKALPAP 450
[1254]IEKTISKAKG QPREPQVYTL PPSRDELTKN QVSLTCLVKGFYPSDIAVEff 500
[1255]ESNGQPENNY KTTPPVLDSD GSFFLYSKLT VDKSRffQQGN VFSCSVMHEA 550
[1256]LHNHYTQKSL SLSPGK566
[1257]通 过位于位置113-120处的接头GGGSGGGG (SEQ ID NO:10)，HBCRCVL序列被融合到H8B5VH序列。通过位于位置233-236处的接头TVSS (SEQ ID NO:269)，h8B5VH序列被融合到Fe序列(两种接头显示为以上的下划线部分)。编码HBCRCVL R45N-h8B5VH_(-4)TVSS-hGl的多核苷酸是:
[1258](SEQ ID NO:277):
[1259]gatgttgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtcacccttggaca 50
[1260]gccggcctcc atctcctgca agtcaagtca gagcctcttagatagtgatg 100
[1261]gaaagacata tttgaattgg tttcagcaga ggccaggccaatctccaaac 150
[1297] 将上述接头引入到质粒中以制备具有不同的接头组合的一组IgDART双抗体:
[1302]该数据出乎意料地表明具有接头例如901A/901B、903A/903B和908A/908B中所采用的接头的构建体提供了比具有例如910A/911B的接头的构建体明显更好的结果(更少的低聚化和/或更少的片段产生)。
[1303]6.15 E-卷曲/K-卷曲 DART
[1304]如根据前述内容将理解的，双特异性DART的单独多肽可形成两种同二聚体物质和一种异二聚体物质。在本发明的一个实施方式中，可将带电荷的多肽添加到一条或更优选地，两条DART多肽的C末端。通过对双特异性DART的单独多肽选择具有相反电荷的带电荷的多肽，包括这些带电荷的多肽有利于异二聚体的形成并减少同二聚体的形成。优选地，带正电荷的多肽将包含大含量的精氨酸、谷氨酰胺、组氨酸和/或赖氨酸(或这些氨基酸的混合物)且带负电荷的多肽将包含大含量的天冬氨酸或谷氨酸(或这些氨基酸的混合物)。包含大量含量的赖氨酸的带正电荷的多肽和包含大含量的谷氨酸的带负电荷的多肽是特别优选的。为了将这些带相反电荷的多肽之间的静电吸引最大化，优选采用能够自发地呈现螺旋构象的多肽。
[1305]因此，在优选的实施方式中，带正电荷的“E-卷曲”将附接到待用来形成双特异性DART的一条多肽上，且带负电荷的“K-卷曲”将附接到DART的第二条多肽上(图37)。
[1306]特别优选的E卷曲将具有序列:(EVAALKE) 4:
[1307]SEQ ID NO:299 EVAALEKEVAALEKEVAALEKEVAALEK
[1308]特别优选的K卷曲将具有序列:(KVAALKE) 4:
[1309]SEQ ID NO:300 KVAALKEKVAALKEgKVAALKEKVAALKE
[1310]具有该E卷曲的优选的DART多肽将具有通用序列:[VL结构域]-[GGGSGGGG]-[VH结构域]-[(EVAALEK) J-GGGNS，其中VL是DART的可变轻链Ig结构域，GGGSGGGG是SEQ IDNO:10，VH是DART 的可变重链 Ig 结构域，ID NO:299，且GGGNS 是 SEQ IDNO:301。具有该K卷曲的优选的DART多肽将具有通用序列:[VL结构域]-[GGGSGGGG] - [VH结构域]-[(KVAALKE) J-GGGNS，其中VL是DART的可变轻链Ig结构域，GGGSGGGG是SEQ IDNO: 10，VH 是 DART 的可变重链 Ig 结构域，(KVAALKE) 4 是 SEQ ID NO:300，且 GGGNS 是 SEQID NO:301。
[1311]6.16包含E-卷曲/K-卷曲Fe的DART
[1312]在另一个实施方式中,Fe-区可被连接到E卷曲或K卷曲DART的E和/或K卷曲。
[1313]更进一步，在包含Fe的DART的Fe区与DART VH结构域之间的分隔在如下情况下是令人期望的:其中这些结构域的较少分隔的排列导致在这些结构域与它们的结合配体之间的相互作用减少，或者以其他方式干扰DART组装。虽然可采用具有任何氨基酸序列的分隔物，但是优选采用形成a螺旋卷曲的分隔物，以使Fe结构域最大化地延伸并突出于可变结构域之外(图37)。因为具有相反电荷的上述卷曲的多肽另外起促进异二聚体形成的作用，所以这些分子是特别优选的分隔物。这种包含卷曲的Fc-DART分子提供了与Fc-DART的益处相似的益处，包括提高的血清半衰期和效应功能召集。对于该目的，上述E卷曲和K卷曲的多肽是特别优选的。
[1314]因此，在优选的实施方式中，包含E卷曲Fe的DART将具有通用序列:[VL结构域]-[GGGSGGGG] - [VH 结构域]-[(EVAALEK) 4] -GGG-始于 D234 (Kabat 编号)的 Fe 结构域，其中VL是DART的可变轻链Ig结构域，GGGSGGGG是SEQ ID NO:10，VH是DART的可变重链Ig 结构域，且(EVAALEK)4 是 SEQ ID NO:299。
[1315]相似地，在优选的实施方式中，包含K卷曲Fe的DART将具有通用序列:[VL结构域]-[GGGSGGGG] - [VH 结构 域]-[(KVAALEK) 4] -GGG-始于 D234 (Kabat 编号)的 Fe 结构域，其中VL是DART的可变轻链Ig结构域，GGGSGGGG是SEQ ID NO:10，VH是DART的可变重链Ig 结构域，且(KVAALEK)4 是 SEQ ID NO:300。
[1316]如以上所指出的，包含卷曲的DART分子或包括包含卷曲的Fe的DART分子可仅包含单一的该卷曲分隔物，或其可包含一个以上的该分隔物(例如，优选地具有相反电荷的两个分隔物，其中一个与DART多肽的每一个VH结构域连接)。通过将Fe区连接到该分隔物分子，增强了通过链交换制备二价、四价等形式的Fc-DART分子的能力(图39)。如图39中所示，可产生Fc-DART分子，其根据Fe结构域被连接到DART VH结构域中的一个还是两个结构域而形成单体或二聚体。
[1317]6.17包含E-卷曲/K-卷曲Fe的DART的功能活性
[1318]E-卷曲和/或K-卷曲Fc-DART物质从具有下列的双特异性DART分子产生:(I)CD79b (BCR复合体)-反应性抗体CB3的轻链和重链可变区和(2) CD32B-反应性抗体2B6的低亲和力变体(称为“YA”变体)的轻链和重链可变区。该抗体的轻链可变区与抗体2B6的轻链可变区的不同之处在于包含突变:N50Y和V51A。因此，抗体YA2B6具有轻链可变区序列:
[1319]EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCRTSQSIGTNIHWYQQKPDQSPKLLIKYASE
[1320]SISGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLEAEDAATYYCQQSNTffPFTFGGGTKVEI
[1321]K (SEQ ID NO:302).[1322]该抗体的重链可变区的序列为:
[1323]QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWIHWVRQAPGQGLEWMGVIDP
[1324]SDTYPNYNKKFKGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARNGDSDYYS
[1325]GMDYffGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:303);或
[1326]选择低亲和力的抗体是因为其将优先顺式地结合表达⑶79b的细胞(B细胞)上的⑶32B。这样一来，该构型将减弱与其他表达⑶32B的细胞(单核细胞、内皮细胞、肝细胞)的相互作用以及不期望的反式相互作用。
[1327]制备了该h2B6YAhCB3DART的E-卷曲和/或K-卷曲衍生物和包含E-卷曲和/或K-卷曲Fe的衍生物。使用尺寸排阻层析分析所产生的分子的大致尺寸和异质性。如图40所示，二聚体由具有被连接到K-卷曲结构域的单一连接的Fe区的E-卷曲/K卷曲DART以及具有被连接到E-卷曲结构域的单一连接的Fe区的E-卷曲/K卷曲DART形成。从其中Fe区被连接到同一 DART分子的E卷曲和K卷曲二者的制剂中回收期望的单体，以及二聚体分子，单体是所形成的大部分产物。图41示出了所产生的二聚体分子的可能结构。
[1328]使用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析尺寸排阻层析的级分以进一步分析所产生的分子的结构(图42)。E-卷曲/K-卷曲DART衍生物(无Fe区)迁移为各自约28kD的两条主带(对应于包含KFc的多肽和稍小的包含EFc的多肽)和较不明显的约49kD的带(对应于E-卷曲/K-卷曲DART)。来自尺寸排阻层析的包含E-卷曲/K-卷曲Fe的DART衍生物的单体级分仅显示出约28kD的较大或较小分子量的带(对应于所述DART是包含KFc的DART(较大分子量的带)或是包含EFc的DART(较小分子量的带))。物质主要迁移到约49kD处(对应于E-卷曲/K-卷曲DART)。还观察到明显的较高分子量的带。
[1329]进行双特异性结合ELISA以表征所产生的分子。⑶79被放到ELISA平板。然后DART被结合到平板上。使用s⑶32B-生物素，接下来与链霉亲和素-HRP —起孵育来检测DART结合。如图43显示，包含E-卷曲/K-卷曲Fe的h2B6YAhCB3DART衍生物(EFc/K或E/KFc)相对于h2B6YAhCB3DART或EFc/KFc h2B6YAhCB3DART衍生物显示明显增强的结合。
[1330]已结合到⑶79b的抗体的交联导致B细胞活化(Van Kooten, C.等人(1997) “Cross-Linking Of Antigen Receptor Via Ig-B(B29, CD79b)Can Induce BothPositive And Negative Signals In CD40_Activated Human B Cells,，，Clin.Exp.1mmunol.110:509-515)。因为 h2B6YAhCB3DART 分子能够结合 CD79b 和 CD32B 抑制性受体，其具有将CD32B“召集”到CD79b的结合位点并从而阻断B细胞增殖的能力。为证实这种能力，将DART与已被暴露于能够交联被结合的抗_CD79b抗体的抗体的B细胞一起孵育。图44中示出了该实验的结果。结果表明只针对⑶79b或⑶32B的抗体(分别是Ch2B6N297Q和ChCB3.1N297Q)不能抑制B细胞增殖。EFc/KFc h2B6YA x hCB3DART衍生物在抑制B细胞增殖方面明显更有效，h2B6YA X hCB3DART本身和h2B6YA x hCB3VF对照也是如此。发现仅具有单连接的Fe区的E卷曲/K卷曲DART (E/KFc h2B6YA x hCB3DART衍生物和EFc/K h2B6YA x hCB3DART衍生物)对B细胞增殖发挥最大抑制。[1331]6.18用于改变体内血清半衰期的DART修饰
[1332]如以上所讨论的，小的重组抗体分子例如双特异性单链分子(例如，具有约55kDa的分子量)将从循环中快速清除。在小鼠中对DART分子的体内药物动力学研究展示了预期的约2小时的短的终点半衰期。
[1333]在一些实施方式中，例如在治疗急性炎症病症时，该短的半衰期是期望的，但是，在其他实施方式中，例如在治疗癌症和慢性疾病及病症时，显示出更长的半衰期的本发明的DART分子是优选的。
[1334]为了提高DART分子用于这些用途的体内药物动力学性质，可将DART分子修饰为在所述DART分子的一个或多个末端包含血清结合蛋白的多肽部分。最优选地，血清结合蛋白的该多肽区部分将被安装在DART分子的C末端。用于该目的的特别优选的血清结合蛋白的多肽部分是来自链球菌G蛋白的白蛋白结合结构域(ABD)。链球菌菌株G418 (Streptococcus strain G148)的G蛋白的白蛋白结合结构域3 (ABD3)是特别优选的。
[1335]来自链球菌菌株G418的G蛋白的白蛋白结合结构域3(ABD3)由形成稳定3_螺旋束的46个氨基酸残基组成且具有广泛的白蛋白结合特异性(Johansson, M.U.等人(2002) “Structure, Specificity, And Mode Of Interaction For BacterialAlbumin-Binding Modules, ^J.Biol.Chem.277 (10):8114-8120)。白蛋白是血衆中最丰富的蛋白并在人体内具有19天的半衰期。白蛋白具有允许其非共价地结合其他蛋白质的多个小分子结合位点并从而延长其半衰期。
[1336]为证实血清蛋白的多肽部分延长DART半衰期的能力，将链球菌G蛋白的ABD3结构域融合到重组的双特异性DART (与h⑶16和h⑶32B抗原免疫反应性的)上以产生重组抗体分子h⑶16-h⑶32B ABD-DART (图45)。该ABD-DART显示出对两种抗原以及与人血清白蛋白(HSA)的特异性结合，并能够在体外再靶向效应细胞。与对照DART相比，该ABD-DART在小鼠中显示出半衰期的强烈增加。这个方法可用作将可能重要的药物如DART的半衰期增加至大于90分钟,大于2小时,大于5小时,大于10小时,大于20小时,且最优选地,大于30小时的可行途径。
[1337]材料和方法:
[1338]ABD DART的设计和构建:使用以下作为链I制备hCD16_hCD32B ABD DART:
[1339]hCD16VL-G3SG4-hCD32BVH-K 卷曲[(KVAALKE) 4]
[1340]其中，CD16VL表示 3G8CD16VL，G3SG4 表示 SEQ ID NO:10，hCD32BVH 表示2B6CD32BVH，且(KVAALKe)4 表示 SEQ ID NO:300 ；
[1341]并使用以下作为链2:
[1342]hCD32BVL-G3SG4-hCD16VH-GGCGGG-E 卷曲[(EVAALEK) 4] -GGGNS-ABD
[1343]其中CD32BVL 表示 CD32BVL, G3SG4 表示 SEQ ID NO:10，hCD16VH 表示 CD16VH,GGCGGG是 SEQ ID NO:267 的残基 2-7, E 卷曲[(EVAALEK)4]是 SEQ ID NO:299 ；GGGNS 是SEQ IDNO:301，且 ABD 为:
[1344]LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNLINNAKT VEGVKALID EILAALP (SEQ ID NO:304)
[1345]因此，链I (h3G8VLl-G3SG4-h2B6VH4-K 卷曲-GGGNS)的序列为:
[1346]DIVMTQSPDS LAVSLGERAT INCKASQSVD FD⑶SFMNWY QQKPGQPPKL
[1347]LIYTTSNLES GVPDRFSGSG SGTDFTLTIS SLQAEDVAVY YCQQSNEDPY
[1348]TFGQGTKLEI KGGGSGGGGQ VQLVQSGAEV KKPGASVKVS CKASGYTFTN
[1349]YffIHWVRQAP GQGLEffIGVI DPSDTYPNYN KKFKGRVTMT VVVSTSTAYM
[1350]ELRSLRSDDT AVYYCARNGD SDYYSGMDYff GQGTTVTVSS GGCGGGKVAA
[1351]LKEKVAALKE KVAALKEKVA ALKEGGGNS(SEQ ID NO:305)
[1352]编码链I (h3G8VLl-G3SG4-h2B6VH4-K卷曲-GGGNS)的优选的多核苷酸是:
[1353]gacatcgtga tgacccaatc tccagactct ttggctgtgt ctctagggga gagggccacc
[1354]atcaactgca aggccagcca aagtgttgat tttgatggtg atagttttat gaactggtac
[1355]caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctata ctacatccaa tctagaatct
[1356]ggggtcccag acaggtttag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caccatcagc
[1357]agcctgcagg ctgaggatgt ggcagtttat tactgtcagc aaagtaatga agatccgtac
[1358]acgttcggac aggggaccaa gcttgagatc aaaggaggcg gatccggcgg cggaggccag
[1359]gttcagctgg tgcagtctgg agctgaggtg aagaagcctg gggcctcagt gaaggtctcc
[1360]tgcaaggctt ctggttacac ctttaccaac tactggatac actgggtgcg acaggcccct
[1361]ggacaagggc ttgagtggat tggagtgatt gatccttctg atacttatcc aaattacaat
[1362]aaaaagttca agggcagagt caccatgacc gtagtcgtat ccacgagcac agcctacatg
[1363]gagctgagga gcctgagatc tgacgacacg gccgtgtatt actgtgcgag aaacggtgat
[1364]tccgattatt actctggtat ggactactgg gggcaaggga ccacggtcac cgtctcctcc
[1365]ggaggatgtg gcggtggaaa agtggccgca ctgaaggaga aagttgctgc tttgaaagag
[1366]aaggtcgccg cacttaagga aaaggtcgca gccctgaaag agggcggcgg gaattct
[1367](SEQ ID NO:306)
[1368]因此，链2 (h2B6VL5-G3SG4-h3G8VH5-E 卷曲-GGGNS-ABD)的序列为:
[1369]EIVLTQSPDF QSVTPKEKVT FTCRTSQSIG TNIHWYQQKP DQSPKLLIKE
[1370]VSESISGVPS RFSGSGSGTD FTLTINSLEA EDAATYYCQQ SNTffPFTFGG
[1371]GTKVEIKGGG SGGGGQVTLR ESGPALVKPT QTLTLTCTFS GFSLSTSGMG
[1372]VGffIRQPPGK ALEffLAHIffff DDDKRYNPAL KSRLTISKDT SKNQVVLTMT
[1373]NMDPVDTATY YCAQINPAWF AYWGQGTLVT VSSGGCGGGE VAALEKEVAA
[1374]LEKEVAALEK EVAALEKGGG NSLAEAKVLA NRELDKYGVS DYYKNLINNA
[1375]KTVEGVKALI DEILAALP(SEQ ID NO:307) [1376]编码链2 (h2B6VL5-G3SG4-h3G8VH5-E 卷曲-GGGNS-ABD)的优选的多核苷酸是:[1377]gaaattgtgc tgactcagtc tccagacttt cagtctgtga ctccaaagga gaaagtcacc
[1378]ttcacctgca ggaccagtca gagcattggc acaaacatac actggtacca gcagaaacca
[1379]gatcagtctc caaagctcct catcaaggag gtttctgagt ctatctctgg agtcccatcg
[1380]aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcaccctca ccatcaatag cctggaagct
[1381]gaagatgctg caacgtatta ctgtcaacaa agtaatacct ggccgttcac gttcggcgga
[1382]gggaccaagg tggagatcaa aggaggcgga tccggcggcg gaggccaggt taccctgaga
[1383]gagtctggcc ctgcgctggt gaagcccaca cagaccctca cactgacttg taccttctct
[1384]gggttttcac tgagcacttc tggtatgggt gtaggctgga ttcgtcagcc tcccgggaag
[1385]gctctagagt ggctggcaca catttggtgg gatgatgaca agcgctataa tccagccctg
[1386]aagagccgac tgacaatctc caaggatacc tccaaaaacc aggtagtcct cacaatgacc
[1387]aacatggacc ctgtggatac tgccacatac tactgtgctc aaataaaccc cgcctggttt
[1388]gcttactggg gccaagggac tctggtcact gtgagctccg gaggatgtgg cggtggagaa
[1389]gtggccgcac tggagaaaga ggttgctgct ttggagaagg aggtcgctgc acttgaaaag`[1390]gaggtcgcag ccctggagaa aggcggcggg aattctctgg ccgaagcaaa agtgctggcc
[1391]aaccgcgaac tggataaata tggcgtgagc gattattata agaacctgat taacaacgca
[1392]aagaccgtgg aaggcgtgaa agcactgatt gatgaaattc tggccgccct gcct
[1393](SEQ ID NO:308)
[1394]使用hCD16-hCD32B DART作为模板通过PCR扩增每个VL和VH区段。对于链2，包含E卷曲和ABD的核苷酸序列通过引物二聚体形成，并然后使用限制性消化和连接将其克隆在hCD16的VH区域的C-末端。两条链在Nhe1-NotII位点处被克隆到pCIneo载体(Promega，Inc.)中。然后将分别具有在NgoMIV-NheI处被消化的链I表达盒和在BstB1-PmeI处被消化的链2表达盒的单独的质粒克隆到单一质粒中，以转染到CHO细胞中形成稳定的细胞系。
[1395]蛋白质的表达和纯化:为了稳定的转染，用h⑶16-h⑶32B EK ABD-DART质粒DNA转染CHO-S细胞。通过亲和层析使用偶联到CNBr活化的S印haix)Se4B的可溶形式的FcRIIB抗原纯化ABD-DART蛋白质。使用Superdex200HR10/30通过尺寸排阻层析进一步纯化所浓缩的蛋白质。
[1396]通过ELISA的结合测定:对于基于⑶16的捕获，在4°C下用浓度为2ug/mL的FcRIIB抗原包被平板过夜。然后用PBS-T中的0.5%蛋白胨封闭平板。在室温下使被稀释在两倍系列稀释液中的纯化的蛋白质结合在平板上，持续I小时。最后，使用生物素化的CD32B(50ng/mL)，接下来HRP偶联的链霉亲和素(1/1000，BD-Pham)进行检测。通过加入TMB测量HRP活性，在0D450nm下在读板机中对平板读数。
[1397]对于人血清白蛋白(HSA)的捕获，在4°C下用浓度为2iig/mL的HSA过夜包被平板。在那之后，继续同样的程序以进行双亲和力ELISA。
[1398]外周血单核细胞介导的ADCC测定:通过LDH释放测定测量细胞毒性。使用Ficoll-Hypaque (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)密度梯度离心根据厂家说明从人全血(Lonza WalkersVille, Inc, Gaithersburg,MD)中纯化外周血单核细胞(PBMC)。将2xl04靶细胞铺板到圆底96孔组织培养板的每个孔中。将I比4系列稀释的不同的DART或抗体分子加至平板中的细胞。在那之后，将6xl05PBMC加至相同的孔。然后在37°C和5%CO2下的孵箱中孵育平板过夜。然后在1200rpm下离心平板5分钟，将50iil的上清液转移到平底ELISA平板中。向每个孔加入50 u ILDH底物溶液(Promega)，并在暗处室温孵育平板30分钟。然后向每个孔加入50 u I终止溶液，并在I小时内在490nim处对平板读数。以0.D.原始读数将每个孔的细胞毒性百分比计算为:
[1399](样品-AICC)/(靶最大值-自发的靶)XlOO
[1400]其中AICC是不依赖抗体的细胞的细胞毒性。使用Prism软件生成剂量反应曲线。
[1401]药物动力学研究:以5mg/kg的h⑶16-h⑶32B DART的单次静脉注射来注射C57B1/6小鼠。在用药前、2min、30min、lh、3h、6h、24h和72h收集小鼠血清。对血清中h⑶16-h⑶32B DART的浓度定量。h⑶16_h⑶32B DART的药物动力学计算通过药物动力学软件包 WinNonlin Professionals.1 (Pharsight Corporation, USA)进行。参数通过无隔分析(NCA)来确定。无隔分析基于需要静脉注射药物的模型(模型201)。线性梯形法用于参数计算。
[1402]结果
[1403]通过ELISA的表达和结合研究:hCD16-hCD32B ABD-DART以6.5mg每升的浓度在哺乳动物CHO-S细胞中有效地表达。纯化的ABD-DART蛋白对相应抗原的结合活性通过ELISA评价。结果表明h⑶16-h⑶32BABD-DART同时结合两种抗原，⑶16以及⑶32B(图46A)。结合曲线与对照h⑶16-h⑶32B DART蛋白的结合吻合。还通过ELISA证实了纯化的hCD16-hCD32B ABD-DART对人血清白蛋白(HSA)的亲和力(图46B)。结果表明ABD融合的DART与HSA的强烈结合，而没有观察到对照h⑶16-h⑶32B DART的结合。为证实ABD-DART分子能够同时结合⑶32B、⑶16A和HSA，将ABD-DART注射到具有固定的HSA的表面上，随后注射2 (OnM CD32B和2OOnM CD16A (F158)(图46C,实线)。在对照实验中(图46C,虚线)，以缓冲液代替抗原。结果表明ABD-DART分子能够同时结合⑶32B、⑶16A和HSA。
[1404]发现h⑶16-h ⑶32B ABD-DART及其ABD融合衍生物显示等效地结合可溶性CD32B(sCD32B)和可溶性CD16A(158F) (sCD16A);可容易地通过DART-ABD融合体结合人血清白蛋白(HSA)的能力来区分DART (图46D-46I)。在⑶16A包被的平板上孵育DART，并在存在或不存在3mg/ml HSA下使用生物素化的s⑶32B检测结合(通过PBS-T中的0.5%蛋白胨进行封闭)。发现DART ABD融合体保留了亲本DART的双特异性结合并显示出不受人血清白蛋白的存在影响地结合s⑶16A和⑶32B(图46J)。
[1405]ABD-DART的体外细胞毒性:为证实该双特异性ABD-DART同时结合两种抗原，效应细胞上的一种抗原和靶细胞上的一种抗原，进行了再导向细胞杀伤测定。使用人PBMC作为效应细胞，hCD16-hCD32B ABD-DART诱导对CD32B阳性B细胞系Daudi的强效的、剂量依赖性的细胞毒性(图47A)。结果表明ABD-DART的效力与亲本DART的效力相等。⑶16x⑶32BDART可结合表达⑶16B的效应细胞并因此召集这些细胞(通过再导向杀伤)以杀伤表达⑶32B的细胞。因此发现⑶16x⑶32B DART显示出针对Raji细胞的强效杀伤(图47B)。
[1406]ABD-DART的药物动力学性质:在单次剂量静脉注射到C57B1/6小鼠中后，通过对血清样品的ELISA分析h⑶16-h⑶32B ABD-DART的药物动力学性质(图48)。两种蛋白质DART和ABD-DART都表现出被从循环中双相清除。ABD-DART的PK研究表明延长的循环时间，具有35.1h的增加的终点半衰期，相比之下，常规DART为1.2小时(图48，表17)。还通过比较曲线下面积(AUC)证实了药物动力学性质的改善。对于构建体ABD-DART，在融合到ABD后，AUC增长到几乎30倍(表17)。
[1407]
[1408]ABD-DART的体内生物学活性:为证实h⑶16_h⑶32B ABD-DART保留了体内生物学活性，对Tg(mCD16-/-hCD16A+32B+)小鼠施用单剂量的ABD-DART或其亲本DART，并监测B细胞、T细胞和PM细胞的浓度。结果表明DART能够抑制B细胞的浓度(图49A)并被解释为表明直到DART被从小鼠循环中清除之前保持对B细胞的靶向的再导向杀伤。DART未抑制T细胞(图49B)和PM细胞(图49C)的浓度，证实了其特异性。
[1409]总之，成功地设计和制备了白蛋白结合结构域融合的DART蛋白(称为ABD-DART)。发现h⑶16-h⑶32B ABD-DART保留了对其识别的两个抗原决定簇:⑶16和⑶32B的特异性。发现ABD-DART表现出与人血清白蛋白的高亲和力。ABD的融合未减少生物活性(即，DART对再导向肿瘤细胞杀伤的效力)。DART分子与ABD的融合导致其体内半衰期的明显改善(增加)，并实现了该目标而没有明显地增加其尺寸。保留小的尺寸的能力是有意义和有优势的，因为其有助于DART扩散到肿瘤组织中的能力。
[1410]6.19 Her2/B 细胞受体 DART
[1411]构建了包含能够结合Her2/neu和T细胞受体(“TCR”)的可变区的IgDART双抗体。
[1412]如以上讨论的，TCR由⑶4+或⑶8+T-细胞天然地表达并允许这些细胞识别被抗原递呈细胞的I类或II类MHC蛋白质结合并递呈的抗原性肽。TCR对pMHC(肽-MHC)复合体的识别引发细胞免疫反应的传播，该细胞免疫反应导致细胞因子的产生和抗原递呈细胞的裂解。ErbB家族的重要成员HER2/neu由于其在多种人类癌和哺乳动物发育中的作用而被透彻地研究(Hynes 和 Stem (1994) Biochim.et Biophys.Actal 198:165-184 ;和 Dougall等人(1994) 0ncogene9:2109-2123 ；Lee 等人(1995)Nature378:394-398)。Semba 等人(1985) Proc.Natl.Acad.Sc1.(U.S.A.)82:6497-6501 和 Yamamoto 等人(1986) Nature319:230-234中描述了人HER2/neu基因和HER2/neu蛋白并且序列可在GenBank中以登记号X03363获得。HER2/neu包含4个结构域:配体所结合的胞外结构域；亲脂性跨膜结构域；保守的胞内酪氨酸激酶结构域；以及具有多个可被磷酸化的酪氨酸残基的羧基-末端信号传导结构域。(Plowman 等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sc1.(U.S.A.) 90:1746-1750)。Franklin等人(2004)Cancer Cell.5(4):317-328描述了 HER2/neu的胞外(ECD)结构域的序列并可在 Protein DataBank RecordlS78 (2004)中获得。
[1413]HER2/neu作为生长因子受体起作用并通常被肿瘤例如乳腺癌、结肠癌、膀胱细胞癌、卵巢癌和肺癌表达。HER2/neu在25-30%的人乳腺和卵巢癌中过表达，并与这些患者的入侵性临床进展和差的预后有关。(Slamon等人(1987) Science235:177-182 ;Slamon等人(1989) Science244:707-712)。还在包括胃癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、肺癌、肾癌、结肠癌、甲状腺癌、胰腺癌和膀胱癌的其他癌中观察到HER2/neu的过表达。(参见，例如King等人(1985) Science229:974 ;McCann 等人(1990) Cancer65:88-92 ;Yonemura 等人(1991)Cancer Research51:1034)。
[1414]已经研发了靶向HRE-1或HER2/neu的大量单克隆抗体和小分子酪氨酸激酶抑制剂，包括，特别是，称为4D5 (HERCEPTIN®, Genentech, Inc.)的鼠单克隆抗体的人源化变体，4D5识别HER2/neu的富含半胱氨酸的结构域II中的胞外表位(氨基酸529至627)，该表位位置非常接近蛋白质的跨膜区。研究已表明在过表达HER2/neu的乳腺癌细胞中，用对HER2/neu特异性的抗体与化疗剂(例如，顺钼、阿霉素、紫杉醇)的组合治疗引发比用单独的化疗剂治疗高的细胞毒性反应。(Hanco*ck等人(1991) Cancer Res.51:4575-4580 ；Arteaga 等人(1994) Cancer54:3758-3765 ；Pietras 等人(1994) 0ncogene9:1829-1838)。HER2/neu抗体可增强对化疗剂的反应的一种可能机制是通过调节HER2/neu蛋白的表达或通过干扰 DNA 修复。(StancoVski 等人(1991) Proc.Natl.Acad.Sc1.(U.S.A.) 88:8691-8695 ；Bacus 等人(1992)Cell Growth&Diff.3:401-411 ；Bacus 等人(1993)CancerRes.53:5251-5261 ；Klapper 等人(1997)0ncogenel4:2099-2109 ；Klapper 等人(2000)Cancer Res.60:3384-3388 ;Arteaga 等人(2001) J Clinical 0ncologyl9 (18s):32s_40s。虽然在某些实例中，抗-HER2/neu抗体例如m_.:RCT7rTIN:A:对患者提供治疗性益处，但是大多数的乳腺癌和其他患者对这些抗体表现出难治性反应。这些反应部分地反映了患者的癌细胞过表达ffiR2/neu的程度方面的差异。
[1415]作为包含能够结合Her2/neu和T细胞受体(“TCR”)的可变区的结果，DART具有结合表达HER2的细胞并因此将能够结合T细胞受体的结构域附到这些细胞的能力。当这些T细胞结合到该结构域时，其激活以引发导致杀伤表达HER2的细胞的免疫反应。
[1416]以下提供了该DART的氨基酸和核酸序列，以普通文本示出了 VL和VH的序列，以加下划线的文本示出了 VL-VH接头并以黑体和斜体示出了编码C-末端异二聚化基序(SEQID NO:313:GFNRGEC 或 SEQ ID NO:314:GVEPKSC)的序列。
[1417]TCRVL-HER2VH 的氨基酸序列(SEQ ID NO:315)
[1418]EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCSATSSVS YMHWYQQKPG KAPKRffIYDT SKLASGVPSR
[1419]FSGSGSGTEF TLTISSLQPE DFATYYCQQff SSNPLTFGQG TKLEIKGGGS GGGGQVQLQQ
[1420]SGPELVKPGA SLKLSCTASG FNIKDTYIHW VKQRPEQGLE WIGRIYPTNG YTRYDPKFQD
[1421]KATITADTSS NTAYLQVSRL TSEDTAVYYC SRWGGDGFYA MDYWGQGASV TVSS GWNSm
[1422]
[1423]编码TCRVL-HEMVH 的核酸序列(SEQ ID NO:316)[1424]gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc
[1425]ctctcctgca gtgccacctc aagtgtaagt tacatgcact ggtatcagca gaaaccaggg
[1426]aaagccccta agcgctggat ctatgacaca tccaaactgg cttctggggt cccatcaagg
[1427]ttcagcggca gtggatctgg gacagaattt actctcacaa tcagcagcct gcagcctgaa
[1428]gattttgcaa cttattactg tcagcagtgg agtagtaacc cgctcacgtt tggccagggg
[1429]accaagcttg agatcaaagg aggcggatcc RRcggcggag gccaggttca gctgcagcag
[1430]tctgggccag agcttgtgaa gccaggggcc tcactcaagt tgtcctgtac agcttctggc
[1431]ttcaacatta aagacaccta tatacactgg gtgaaacaga ggcctgaaca gggcctggaa[1432]tggattggaa ggatttatcc tacgaatggt tatactagat atgacccgaa gttccaggac
[1433]aaggccacta taacagcaga cacatcctcc aacacagcct acctgcaggt cagccgcctg
[1434]acatctgagg acactgccgt ctattattgt tctagatggg gaggggacgg cttctatgct
[1435]atggactact ggggtcaagg agcctcggtc accgtgagct cc 雜德觸魏
[1436]寧
[1437]HER2VL-TCRVH 的氨基酸序列(SEQ ID NO:317)
[1438]DIVMTQSHKF MSTSVGDRVS ITCKASQDVN TAVAWYQQKP GHSPKLLIYS ASFRYTGVPD
[1439]RFTGSRSGTD FTFTISSVQA EDLAVYYCQQ HYTTPPTFGG GTKVEIKGGG SGGGGQVQLV
[1440]QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYKFTSYVMH WVRQAPGQGL EWIGYINPYN DVTKYNEKFK
[1441]GRVTITADKS TSTAYMELSS LRSEDTAVHY CARGSYYDYD GFVYWGQGTL VTVSS mmm
[1442]SC
[1443]编码HEM VL-TCRVH 的核酸序列(SEQ ID NO:318)
[1444]gacatcgtga tgacccagtc ccacaagttc atgtccacct ctgtgggcga tagggtcagc
[1445]atcacctgca aggccagcca ggatgtgaat actgctgtag cctggtatca gcagaaacca
[1446]ggacattctc ccaaactgct gatttactcc gcatccttcc ggtacactgg agtccctgat
[1447]cgcttcactg gcagcagatc tgggacagat ttcactttca ccatcagcag tgtgcaggct
[1448]gaagacctgg cagtttatta ctgtcagcaa cattatacta cacctcccac cttcggaggg
[1449]ggtaccaagg tggagatcaa aggaggcgga tccRRCRRCR gaggccaggt tcagctggtg
[1450]cagtctggag ctgaggtgaa gaagcctggg gcctcagtga aggtctcctg caaggccagc
[1451]ggttacaagt ttaccagcta cgtgatgcac tgggtgcgac aggcccctgg acaagggctt
[1452]gagtggatcg gatatattaa tccttacaat gatgttacta agtacaatga gaagttcaaa
[1453]ggcagagtca cgattaccgc ggacaaatcc acgagcacag cctacatgga gctgagcagc
[1454]ctgagatccg aggacacggc cgtgcactac tgtgcgagag ggagctacta tgattacgac
[1455]gggtttgttt actggggcca agggactctg gtcactgtga gctcc gg^gt tg^Bgcccaaa
[1456]tctCg^t
[1457]在优选实施方式中，这些构建体被修饰为包含有利于形成异二聚体(即，TCRVL-HER2VH x HER2VL-TCRVH二聚体)的E卷曲或K卷曲结构域。以下提供了用于该DART的氨基酸和核酸序列，以普通文本示出了 VL和VH的序列，以加下划线的文本示出了 VL-VH接头，并以斜体示出了编码用于二聚化的包含Cys的接头的序列(GGCGGG;SEQ ID NO:267的残基2-7)。E卷曲或K卷曲异二聚化结构域是加双下划线的(优选的“E-卷曲”序列是七聚EVAALEK的4次重复；SEQ ID NO:299 ;优选的“K-卷曲”序列是七聚KVAALKE的4次重复(SEQ ID NO:300) 0跟在E卷曲或K卷曲后面的序列没有确定的功能。
[1458]TCRVL-HER2VH-E 卷曲的氨基酸序列(SEQ ID NO:319)
[1459]EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCSATSSVS YMHWYQQKPG KAPKRffIYDT SKLASGVPSR
[1460]FSGSGSGTEF TLTISSLQPE DFATYYCQQff SSNPLTFGQG TKLEIKGGGS GGGGQVQLQQ
[1461]SGPELVKPGA SLKLSCTASG FNIKDTYIHW VKQRPEQGLE WIGRIYPTNG YTRYDPKFQD[1462]KATITADTSS NTAYLQVSRL TSEDTAVYYC SRWGGDGFYA MDYWGQGASV TVSS GGCGGG
[1463]£VAAL.£KEVA ALEKEVAfeLS KSVAALEK: ga GNS
[1464]编码TCRVL-HER2VH-E 卷曲的核酸序列(SEQ ID NO:320)
[1465]gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc
[1466]ctctcctgca gtgccacctc aagtgtaagt tacatgcact ggtatcagca gaaaccaggg
[1467]aaagccccta agcgctggat ctatgacaca tccaaactgg cttctggggt cccatcaagg
[1468]ttcagcggca gtggatctgg gacagaattt actctcacaa tcagcagcct gcagcctgaa
[1469]gattttgcaa cttattactg tcagcagtgg agtagtaacc cgctcacgtt tggccagggg
[1470]accaagcttg agatcaaagg aggcggatcc RRcggcggag gccaggttca gctgcagcag
[1471]tctgggccag agcttgtgaa gccaggggcc tcactcaagt tgtcctgtac agcttctggc
[1472]ttcaacatta aagacaccta tatacactgg gtgaaacaga ggcctgaaca gggcctggaa
[1473]tggattggaa ggatttatcc tacgaatggt tatactagat atgacccgaa gttccaggac
[1474]aaggccacta taacagcaga cacatcctcc aacacagcct acctgcaggt cagccgcctg
[1475]acatctgagg acactgccgt ctattattgt tctagatggg gaggggacgg cttctatgct
[1476]atggactact ggggtcaagg agcctcggtc accgtgagct ccggaggatg tggcggtgga
[1477]mmrnmm msmamm aaaaaiiast mMmmmMmmmM
[1478]:553£S£:5-rS2s.qaaa ggcggc gggaattct
[1479]HER2VL-TCRVH-K 卷曲的氨基酸序列(SEQ ID NO:321)
[1480]DIVMTQSHKF MSTSVGDRVS ITCKASQDVN TAVAWYQQKP GHSPKLLIYS ASFRYTGVPD
[1481]RFTGSRSGTD FTFTISSVQA EDLAVYYCQQ HYTTPPTFGG GTKVEIKGGG SGGGGQVQLV
[1482]QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYKFTSYVME WVRQAPGQGL EWIGYINPYN DVTKYNEKFK
[1483]GRVTITADKS TSTAYMELSS LRSEDTAVHY CARGSYYDYD GFVYWGQGTL VTVSSGGCGG
[1484]GisaaMEEV AAL^VAAl MMMkM G GGNS
[1485]编码HER2VL-TCRVH-K 卷曲的核酸序列(SEQ ID NO:322)
[1486]gacatcgtga tgacccagtc ccacaagttc atgtccacct ctgtgggcga tagggtcagc
[1487]atcacctgca aggccagcca ggatgtgaat actgctgtag cctggtatca gcagaaacca
[1488]ggacattctc ccaaactgct gatttactcc gcatccttcc ggtacactgg agtccctgat
[1489]cgcttcactg gcagcagatc tgggacagat ttcactttca ccatcagcag tgtgcaggct
[1490]gaagacctgg cagtttatta ctgtcagcaa cattatacta cacctcccac cttcggaggg
[1491]ggtaccaagg tggagatcaa aggaggcgga tccggcggcg gaggccaggt tcagctggtg
[1492]cagtctggag ctgaggtgaa gaagcctggg gcctcagtga aggtctcctg caaggccagc
[1493]ggttacaagt ttaccagcta cgtgatgcac tgggtgcgac aggcccctgg acaagggctt
[1494]gagtggattg gatatattaa tccttacaat gatgttacta agtacaatga gaagttcaaa
[1495]ggcagagtca cgattaccgc ggacaaatcc acgagcacag cctacatgga gctgagcagc
[1496]ctgagatccg aggacacggc cgtgcactac tgtgcgagag ggagctacta tgattacgac
[1497]gggtttgttt actggggcca agggactctg gtcactgtga gctccggagg atgtggcggt
[1498]ggaiiiassi issssuisaii iiaaiisaMmsmrnsm[1499]smmm&msm§£M ggc ggcgggaatt ct
[1500]对具有Her2和T-细胞受体(TCR)结合结构域的DART分子测试了其在多种乳腺癌、结肠癌和膀胱癌细胞系中介导细胞毒性的能力，这些细胞系之前已被表征为显示出低水平的HER2表达(且因此是用抗-Her2/neu抗体Hercepdn®的治疗难治的)。所测试的乳腺癌细胞系是 ZR75-1 (HER22+)(图 50A)、MCF_7 (HER21+)(图 50B)和 MDA-MB468 (HER2_ve)(图50C)。所测试的非乳腺癌细胞系是HT-29 (结肠癌细胞系)(图50D)和SW780 (膀胱癌细胞系)(图50E)。如在图49A-E显示的，根据达到等价细胞毒性所需的浓度，并根据所观察到的细胞毒性的最大水平，该DART分子在介导肿瘤来源细胞系的细胞毒性方面明显比HERCEPTM® 更有效。
[1501]6.20 DART和ABD通过E卷曲和K卷曲的体外融合
[1502]如以上所讨论的，本发明的DART分子可被设计为表现出对NKG2D受体以及对半抗原荧光素的亲和力的双特异性结合，使得其可用作能够共连接NKG2D受体和与荧光素偶联的结合配偶体相互作用的分子的通用衔接子。为进一步证实ABD的用途，使用下列多肽链构建了 DART:
[1503](I) KYK2VL-4420VH-GFNRGEC (SEQ ID NO:313) -E 卷曲:使用上述 KYK2.0 抗体(Kwong,KY 等人(2008) “Generation,Affinity Maturation.And Characterization Of AHuman Ant1-Human NKG2D Monoclonal Antibody With Dual Antagonistic And AgonisticActivity, ” J.Mol.Biol.384:1143-1156 ；以及 PCT/US09/54911)的 VL 结构域和上述抗荧光素MAb4420的VH结构域构建该多肽。
[1504](2) 4420VL-KYK2VH-GVEPKSC (SEQ ID NO:314):使用上述抗荧光素 MAb4420 的 VL结构域和KYK2.0抗体的VH结构域构建该多肽。“E卷曲”表示七聚EVAALEK的4次重复的E卷曲氨基酸序列；SEQ ID NO:299o
[1505]KYK2VL-4420VH-GFNRGEC (SEQ ID NO: 3 I 3) -E 卷曲和4420VL-KYK2VH-GVEPKSC(SEQ ID NO:314)多肽转染到CHO细胞中以表达命名为“KYK24420VF E卷曲”的DART。图51A和51B中示出了这些分子的纯化。KYK24420VF E卷曲DART的亲和力通过用NKG2D Fc012210检测DART与被捕获的FITC抗原的结合来确定。实验结果证实DART能够结合两种分子(图52)。
[1506]另外，制备了 K卷曲-GGGNS (SEQ ID NO:301)-ABD融合体，其中“K卷曲”表示七聚EVAALEK的4次重复的K卷曲氨基酸序列(SEQ ID NO:300)。图53提供了质粒pPAL7的限制性图谱，并描绘了质粒PPAL7K卷曲ABD的构建，该质粒使用了有助于纯化的PkmnityeXA(T™ (Bio-Rad, Hercules, CA)标签表达 K 卷曲-ABD 融合体。将 pPAL7K 卷曲 ABD 载体转化到大肠杆菌BL21DE3细胞中。带标签的K卷曲ABD的表达通过加入2mMIPTG来诱导，持续4小时。通过SDS-PAGE或蛋白质印迹验证蛋白的表达。简单来说，Pkqfinity e X.VT1 ”融合标签系统包括介导细胞裂解，将所释放的蛋白质结合到固定了枯草杆菌蛋白酶的亲和柱上，洗涤柱子以洗脱掉未结合的蛋白质，使用包含氟化物的洗脱缓冲液来激发枯草杆菌蛋白酶快速和精确地在裂解识别位点后面将标签从融合蛋白上裂解下来，这种裂解后从柱上洗下无标签的蛋白质并在PBS中透析所洗脱的蛋白质。图54示出了通过Pkqfinity eXACT顶纯化树脂纯化(来自IOml培养物的小规模)到的K卷曲ABD蛋白的蛋白质印迹分析。
[1507]使用SDS-PAGE进一步纯化从Pkqfinity e XACTtm纯化树脂得到的K卷曲-AFD蛋白(图55)。250ml大肠杆菌培养物产生6.523mg的纯化的蛋白质(表18)。
[1508]
[1509]KYK24420VF E卷曲DART和K卷曲ABD蛋白在室温下在PBS中孵育30分钟以形成具有改善的性质的E卷曲-K卷曲ABD DART。ELISA结果表明复合体中的所有结构域能够结合其各自的配体(图56A-56C)。如期望的话，可使用抗EK柱实现KYK24420VF E卷曲和K-ABD复合体的进一步纯化。
[1510]因为复合体的形成不依赖于DART的特定结合结构域，所以上述方法可用来制备具有其他结合特异性的E卷曲-K卷曲ABD DART (例如，通过将⑶32B (例如，抗体2B6) /CD16A (例如，抗体3G8) VF E DART与K卷曲ABD复合)。
[1511]因此，如以上指出的，在本发明的一个实施方式中，DART的两条包含抗原结合结构域的多肽可包含用来驱动异二聚体形成的另外的序列(例如，K卷曲或E卷曲)且任选地这些多肽中的一种可包含能够结合血清蛋白的血清结合蛋白的多肽部分(例如，图45)。在替代实施方式中，DART的包含抗原结合结构域的多肽中的一条，且优选地仅一条，可包含该另外的序列以驱动异二聚体形成(例如，K卷曲或E卷曲)且该DART可包含具有另外(例如，第三条)多肽的复合体，其不包含抗原结合位点，但是包含具有用于驱动异二聚体形成的补充序列的多肽(例如，当DART的包含抗原结合结构域的多肽包含E卷曲时为K卷曲；或当DART的包含抗原结合结构域的多肽包含K卷曲时为E卷曲)和任选地能够结合血清蛋白的血清结合蛋白的多肽部分。该另外(例如，第三条)的多肽的血清结合蛋白的多肽部分可位于具有该补充序列的多肽的N末端或C末端。
[1512]如对本领域技术人员将明显的，可对本发明进行许多修改和改变而不偏离其精神和范围。仅通过示例的方式提供了本文描述的具体实施方式，且本发明将仅被所附权利要求的措辞以及这些权利要求被授予的全部等同物的范围所限制。这些修改被期望落在所附权利要求的范围内。本文提及的所有参考文献、专利和非专利通过引用且为所有目的被全部并入本文，其程度如同明确并单独地指明为了所有目的将每个单独的出版物或专利或专利申请通过弓I用全部并入本文。
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